BVDV RT-LAMP檢測方法的建立及BRV和BVDV二聯(lián)滅活疫苗的初步研制.pdf

1、牛輪狀病毒(BovineRotavirus，BRV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)的病毒，牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的病毒，二者都可以造成犢牛的腹瀉。另外，BVDV還是引發(fā)繁殖障礙、粘膜病、持續(xù)性感染等疾病的病原。近年來，BRV和BVDV對于全球養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的危害，嚴(yán)重阻礙

2、了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。
　　 本研究首先從犢牛的腹瀉物中分離出兩株BVDV的保定地方株，分別以BD-2和BD-4為其命名。將分離株在MDBK細(xì)胞上傳20代，對F1和F20代細(xì)胞毒測序鑒定，分析其基因變異程度;同時利用TCID50對F1、F10和F20代細(xì)胞毒的毒力進(jìn)行測定，從而選取了更為穩(wěn)定的BD-2株作為疫苗株。
　　 同時，針對BD-2編碼gP48蛋白的基因序列應(yīng)用PrimerExplorerV4軟件，對該基因序列的保守區(qū)

3、設(shè)計了4條RT-LAMP引物，旨在建立一種針對編碼gP48蛋白基因序列的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT-LAMP)的快速檢測方法。優(yōu)化了反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，檢測了該方法的特異性和靈敏度。結(jié)果表明，該方法在等溫條件下只需要40min就能檢測出結(jié)果，與普通RT-PCR方法相比更加省時，且在判定檢測結(jié)果時無需昂貴的儀器設(shè)備，具有高特異性、高靈敏度、操作簡便快速等特點(diǎn)，適合于基層臨床檢測的應(yīng)用。
　　 實(shí)驗(yàn)室保存的BRVRV+株在

4、Marc-145上傳20代，亦對F1和F20代細(xì)胞毒測序鑒定，分析其基因變異程度;同時利用TCID50對其F1、F10和F20代細(xì)胞毒的毒力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)該株BRV穩(wěn)定性良好，可以作為疫苗株使用。然后，選取TCID50適宜的RV+株F1代毒和BD-2株F5代毒滅活，制成BRV和BVDV二聯(lián)油乳劑滅活疫苗。對于研制出的二聯(lián)滅疫活苗在昆明系小白鼠上進(jìn)行安全性和免疫效力的實(shí)驗(yàn)室初步檢測。結(jié)果顯示，對小鼠的保護(hù)率達(dá)93.3％，并且安全性良好。<