逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Rt-LAMP)技術(shù)檢測(cè)仙臺(tái)病毒的方法建立與應(yīng)用.pdf

1、仙臺(tái)病毒(Sendaivirus，SeV)屬于副粘病毒科副粘病毒屬，是一個(gè)單股負(fù)鏈RNA病毒，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠等嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均易感。仙臺(tái)病毒傳染性強(qiáng)、易擴(kuò)散，一般呈隱性感染，是嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最難控制的病毒之一，鼠群感染仙臺(tái)病毒后會(huì)改變體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)，干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此建立快速診斷方法十分必要。為了在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域使診斷仙臺(tái)病毒的檢測(cè)更為特異、敏感、快速，本研究旨在利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)構(gòu)建出

2、仙臺(tái)病毒的檢測(cè)方法，并通過(guò)初期臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了檢測(cè)方法的可靠性，為仙臺(tái)病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群中的凈化和控制提供相應(yīng)的支持手段。
　　 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)檢測(cè)仙臺(tái)病毒的方法構(gòu)建主要包括如下幾個(gè)步驟:引物設(shè)計(jì)與篩選;體系優(yōu)化;試劑配置;特異性、靈敏性及符合性實(shí)驗(yàn)。引物設(shè)計(jì)方面本研究從在NCBI下載仙臺(tái)病毒(GI:9627219)全基因組，選擇較為保守的融合蛋白(FusionProtein，F(xiàn)P)基因作為靶基因，與多

3、種突變株FP基因進(jìn)行比對(duì)，確定高度保守序列即靶序列，并設(shè)計(jì)出三套引物。并通過(guò)LAMP標(biāo)準(zhǔn)試劑盒篩選出最理想的一套;從病毒增殖液中提取病毒RNA作為模板，采用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)鎂離子，dNTPs、Betaine、內(nèi)外引物等影響因子的用量以及反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間做出了篩選，從而對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并將根據(jù)優(yōu)化結(jié)果裝配了反應(yīng)試劑;在體系靈敏性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)病毒模板進(jìn)行梯度倍比稀釋后，SeVRT-LAMP最低可以檢測(cè)到10-5梯度，最低檢出限為0.95p

4、g，是SeVRT-PCR檢測(cè)靈敏度的30倍;在特異性實(shí)驗(yàn)中，SeVRT-LAMP僅檢測(cè)出仙臺(tái)病毒，并通過(guò)酶切反應(yīng)證實(shí)其特異性擴(kuò)增，其他如CDV等病原微生物的檢出率為0;在符合性實(shí)驗(yàn)中，SeVRT-LAMP法檢測(cè)結(jié)果與上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督站采用ELISA方法檢測(cè)的結(jié)果陽(yáng)性符合率達(dá)到100％;
　　 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)檢測(cè)仙臺(tái)病毒的初步應(yīng)用主要包括如下兩個(gè)步驟:人工攻毒回歸實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用。人工攻毒回歸實(shí)驗(yàn)中，

5、無(wú)論是血清樣本還是肺組織樣本，SeVRT-LAMP檢測(cè)法的陽(yáng)性檢出率為100％;臨床應(yīng)用中，采用病毒分離、RT-PCR及RT-LAMP三種方法同時(shí)對(duì)50份待檢樣本進(jìn)行仙臺(tái)病毒檢測(cè)。其中，病毒分離法檢測(cè)出陽(yáng)性8份，陽(yáng)性感染率16％;RT-PCR檢測(cè)出陽(yáng)性9份，陽(yáng)性感染率18％;RT-LAMP檢測(cè)出陽(yáng)性11份，陽(yáng)性感染率22％。其中，病毒分離法檢測(cè)為陽(yáng)性的，RT-LAMP法檢測(cè)均為陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)出其中的7份;病毒分離為陰性的，RT-

6、LAMP檢測(cè)出其中3份為陽(yáng)性;RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的，RT-LAMP法檢測(cè)均為陽(yáng)性;有兩份樣品僅有RT-LAMP法檢測(cè)為陽(yáng)性，SeVRT-LAMP與病毒分離法的陽(yáng)性符合率為100％，SeVRT-PCR與病毒分離法的陽(yáng)性符合率為87.5％，具體匯總在表。與上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢疫站的檢測(cè)結(jié)果對(duì)照，RT-PCR與RT-LAMP有差異的2份樣本中，有1份樣本ELISA檢測(cè)為可疑，1份樣本檢測(cè)為陽(yáng)性。綜合計(jì)算，SeVRT-LAMP與SeVRT

7、-PCR的一致率為92％。值得一提的是，臨床應(yīng)用中的SeVRT-LAMP檢測(cè)體系加入了鈣黃綠素顯色劑作為指示，反應(yīng)結(jié)束后可直接用肉眼進(jìn)行判斷。
　　 本研究所構(gòu)建的SeVRT-LAMP檢測(cè)方法快速靈敏，操作便捷、判定簡(jiǎn)單，為SeVRT-LAMP試劑盒的研制打下了良好的基礎(chǔ)。如果設(shè)計(jì)出環(huán)引物，并優(yōu)化鈣黃綠素顯色劑中錳離子與鈣黃綠素的比例，可以進(jìn)一步提升擴(kuò)增效率，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用?？傊?，相比目前廣泛使用的血清學(xué)檢測(cè)法，Se