快速檢測魚類淋巴囊腫病毒和海洋雙RNA病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與應用.pdf

1、淋巴囊腫病毒(Lympbocystis disease virus,LCDV)廣泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科共計140種以上魚類,是對魚類危害較為嚴重的病毒病之一,其感染率可高達80％,死亡率可達30％。本研究根據(jù)GenBank登錄的淋巴囊腫病毒的主要衣殼蛋白(MCP)基因序列(AB212999),選擇其高度保守區(qū)域,利用Primer Explorer V3軟件進行引物設計,建立了用于檢測淋巴囊腫病毒的環(huán)介導

2、恒溫擴增方法,對LCDV-LAMP反應條件進行了優(yōu)化,評估了該方法的特異性、靈敏度并用建立的方法對109尾牙鲆進行了檢測。特異性試驗證實,該方法只能檢測LCDV核酸,與流行性造血器官壞死病毒、虎紋蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒、真鯛虹彩病毒及對蝦白斑綜合癥病毒都無交叉反應,具有高度的特異性。將LAMP與常規(guī)PCR及實時定量PCR的檢測限進行比較分析,結(jié)果表明LAMP與實時定量PCR的檢測限一致約為15 f

3、g,比常規(guī)PCR靈敏度高10倍。用建立的LCDV-LAMP與常規(guī)PCR檢測109尾牙鲆樣品,結(jié)果顯示,兩者對健康和發(fā)病嚴重的樣品檢測結(jié)果一致,但對無臨床癥狀的樣品存在8尾差異；經(jīng)2次實時定量PCR復檢差異樣品,均與LAMP一致,表明LAMP較常規(guī)PCR的檢測靈敏度更高,而且從樣品的制備到獲得結(jié)果僅需2 h,具有檢測周期短的優(yōu)勢。以上結(jié)果表明,采用LAMP法檢測淋巴囊腫病毒具有特異性好、靈敏度高、檢測耗時短等特點,比較適合養(yǎng)殖場、出入境口

4、岸進行淋巴囊腫病毒的現(xiàn)場、即時檢測。
　　 海洋雙RNA病毒(Marine birnavirus,MABV)廣泛分布于世界各地的海水中,可感染30科11種軟體、4種甲殼動物和10多種魚類,特別是對鰤幼魚危害嚴重的病毒病之一,其感染率可高達85％,死亡率可達62％。本研究根據(jù)GenBank提供的海洋雙RNA病毒聚合蛋白(polyprotein)的VP2基因序列(D61384),利用PrimerExplorer V3軟件進行引物設計

5、,建立了海洋雙RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導恒溫擴增方法。對MABV RT-LAMP反應條件進行了優(yōu)化,評估了該方法的特異性和靈敏度,并采用優(yōu)化了的方法對養(yǎng)殖場送檢的鱸魚、真鯛、大菱鲆和牙鲆各30尾進行MABV的檢測。結(jié)果顯示,該方法對MABV核酸有高度的特異性,與染性胰臟壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、鯉春血癥病毒、病毒性出血敗血癥病毒及病毒性神經(jīng)壞死病毒都無交叉反應。靈敏性試驗發(fā)現(xiàn),該方法最低檢測限為16.6 fg總RNA,與實時定量R