魚類淋巴囊腫病毒核酸檢測診斷技術的研究.pdf

1、由淋巴囊腫病毒(Lymphocystisdiseasevirus，LCDV)引起的淋巴囊腫病主要表現(xiàn)為一種慢性皮膚瘤，通常發(fā)生于魚的體表皮膚、鰭等處。目前，該病在世界范圍內已感染了包括海水、淡水和半咸水的42科125種以上的魚類。自從1992年，我國在養(yǎng)殖的石斑魚、紅魚中發(fā)現(xiàn)淋巴囊腫病以來，受感染的魚類已有真鯛(Pagrosomusmajor)、鱸(Lateolabraxjaponica)、紫紅笛鯛(Lutjanusargentimac

2、ulatus)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)等10余種。淋巴囊腫病是一種慢性疾病，潛伏期長達幾個星期，發(fā)病后的魚體外觀丑陋，使之喪失商品價值，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失，制約了海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，建立淋巴囊腫病的早期檢測和診斷技術對控制該病的發(fā)生和蔓延顯得尤為重要。 在國家自然科學基金項目的資助下，本文建立了淋巴囊腫病毒的核酸檢測診斷技術，并開展了該病流行情況的調查。 取青島市黃島某養(yǎng)殖場具典型

3、癥狀的牙鲆體表囊腫，經(jīng)勻漿機勻漿、凍融三次、手動勻漿、超聲波破碎后，通過差速離心和蔗糖密度梯度離心，在37％～40％和47％～50％的蔗糖界面上有折光帶形成。經(jīng)負染，透射電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)37％～40％帶中病毒粒子較少，雜質較多；47％～50％帶中病毒粒子密度大，基本沒有雜質，且病毒完整，直徑約為230nm。 病毒粒子經(jīng)蛋白酶K和SDS消化后，用苯酚/氯仿抽提法提取病毒核酸，產(chǎn)量約為2.30μg/μl。病毒基因組DNA用BanⅡ、B

4、glⅡ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后，形成的片段數(shù)目分別為4、11、10、10、6、17和4。以λDNA/HindⅢ酶切片段和DNAMarkerDL2,000作為標準，用Bio-RadQuantityOne軟件計算出各酶切片段的分子量，由各酶切片段總和計算出LCDV青島分離株的基因組DNA大小平均值約為56.0kb，即Mr約為37.0×106D。病毒DNA經(jīng)HpaⅡ和MspⅠ酶切進行的甲基化分析表明，病毒

5、基因組DNA能被對CpG甲基化修飾不敏感的MspⅠ切開，而不能被CpG甲基化修飾敏感的HpaⅡ切開，由此證明LCDVDNA胞嘧啶5'端高度甲基化。 根據(jù)LCDV的主要核衣殼蛋白基因序列(GenBank：AF126405)，設計了一步PCR和巢式PCR引物。在根據(jù)Primerpremier5.0分析獲得的引物退火溫度基礎上，分別采用在47.0、48.1、49.0、50.2和51.4℃不同的退火溫度來進行PCR反應時，二種PCR反應

6、的特異性均沒有受到影響，各反應都可從LCDVDNA中擴增出特異性的目的片段，而對健康牙鲆組織DNA呈陰性反應；在不同退火溫度下，巢式PCR擴增效率不變，而一步PCR則不同，在退火49.0℃的時候，特異性產(chǎn)物的量最大。將LCDVDNA進行10倍梯度稀釋后分別作為模板，一步PCR和巢式PCR靈敏度實驗的結果顯示：一步PCR可檢測出低至1×10-4μg的病毒DNA，而巢式PCR技術，低至1×10-9μg的病毒DNA即可被檢出，這說明以上兩種P

7、CR檢測技術具有高度的特異性和靈敏性。 利用含digoxigenin-11-dUTP的dNTP混和液，通過一步PCR反應合成了地高辛(DIG)標記核酸探針，在此基礎上分別建立了斑點雜交(Dot-Blot)檢測技術和原位雜交檢測技術。通過Dot-Blot檢測表明，探針可以特異性地與病毒DNA進行結合，而與健康牙鲆組織DNA的雜交反應呈陰性。將LCDVDNA進行10倍梯度稀釋后分別作為模板，Dot-Blot靈敏度實驗的結果顯示：Do

8、t-Blot的最小檢測量為l00ng病毒DNA。經(jīng)冰凍切片后進行原位雜交檢測，在囊腫細胞的細胞質內發(fā)現(xiàn)大量的藍黑色的細胞沉淀物，主要聚集在細胞的邊緣部分，石蠟切片后H&E染色確定這些沉淀物為嗜堿性的包涵體，表明通過原位雜交可以在組織細胞內直接定位病毒的原有位置。 LCDV基因組DNA用BanⅡ、BglⅡ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后，使用DIG標記的核酸探針，對其進行了Southern雜交分析，結

9、果表明：在BanⅡ-A(30.4kb)、BglⅡ-C(8.4kb)、ScaⅠ-A(19.3kb)、EcoRⅠ-A(19.3kb)、PstⅠ-B(19.8kb)、HincⅡ-E(4.0kb)和BamHⅠ-A(28.2kb)酶切片段上，各有一條雜交陽性帶。 應用本文建立的PCR和原位雜交兩種技術，對淋巴囊腫病流行情況初步調查的結果顯示：該病流行范圍廣，可感染多種魚類，包括牙鲆(Paralichthysolivaceus)、黑鲪(Se

10、bastodesfuscescens)、紋腹叉鼻鲀(Arothronhispidus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、紅頭魚(Lepidoriglamicroptera)和鱸魚(Lateolabraxjaponicus)。本研究分析推測，LCDV可通過近海海域野生魚或由鮮活餌料傳染給我國養(yǎng)殖經(jīng)濟、觀賞魚類。在利用PCR技術檢測不同地域LCDV時發(fā)現(xiàn)，使用韓國檢測LCDV引物檢測我國北方地區(qū)患病牙鲆時，其擴增片段大小與