委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒核酸與抗體快速檢測技術研究.pdf

1、R e s e a r c h o f r a p i d d e t e c t i o no fV e n e z u e l a n e q u i n ee n c e p h a l i t i sV “ I Fl r U S一 一 ● o ?‘ ●n u c l e i c a c i da n da n t i b o d y U c l e i caT h e s i ss u b m i t t e d t oQ i

2、n g d a o A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yI n F u l f i l l m e n t o f t h e R e q u i r e m e n tf o rt h eD e g r e e o fM a s t e r o f A g r o n o m yY u J u n c h a o( D e p a r t m e n t o f A n i m a l

3、S c i e n c ea n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e )S u p e r v i s o r ：P r o f ．Z h a n g L e c u iP r o f ．Z h a n g H e x i a o青島農業(yè)大學碩士學位論文 摘要委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒核酸與抗體快速檢測技術研究摘要委內瑞拉馬腦炎( V e n e z u e l a ne q u i n ee n c

4、 e p h a l i t i s ，V E E ) 是由委內瑞拉馬腦炎病毒( V e n e z u e l a n e q u i n ee n c e p h a l i t i sv i l x I S ，ⅦE V ) 引起的自然疫源性疾病，本病危害人類的健康，并且可以造成嚴重的經濟損失。本研究成功克隆并表達了V E E V 結構蛋白E 2 基因，利用原核表達的重組E 2 蛋白成功建立了檢測V E E V 結構蛋白I g M

5、抗體的間接E L I S A 方法，并且利用T a q M a n 技術建立了V E E V 的實時定量R T - P C R 檢測方法。以委內瑞拉馬腦炎病毒( ⅦE V ) E 2 基因為目的基因，設計一對特異性引物，擴增目的序列，然后克隆至原核表達載體p E T - 3 2 a ，構建重組表達質粒p E T - E 2 。將重組質粒轉化大腸桿菌R o s e t t a 后，經1 m m o l ／L I P T G 誘導E 2 目

6、的蛋白表達。純化后的表達產物經S D S - P A G E 電泳，得到5 0 K D 左右的清晰的蛋白條帶，符合預期結果。W e s t e r n - b l o t分析證明，重組蛋白可被委內瑞拉馬腦炎病毒陽性血清所識別。以純化的重組蛋白E 2 為抗原，建立了檢測E 2 蛋白抗體的間接E L I S A 方法，確定了間接E L I S A 方法的最佳反應條件。結果表明，重組E 2 蛋白的最適包被濃度為1 ：1 0 0 ；待檢血清的最

7、適稀釋度為1 ：2 0 0 ；重組蛋白最適包被條件為4 ℃過夜；最佳封閉液為2 ％明膠；血清樣本的陰陽性臨界值為O ．5 3 2 2 ．交叉反應試驗和敏感性試驗證明該方法特異性強、敏感性高。本試驗還建立了快速檢測v E E V 的熒光定量R T - P C R 方法。根據(jù)V E E V E 2 基因，利用O l i 9 0 6 ．3 軟件設計了引物和T a q M a n 探針，通過優(yōu)化各項反應條件，建立了實時熒光定量R T - P C