馬病毒性動脈炎新型快速分子檢測技術(shù)研究與應(yīng)用.pdf

1、馬動脈炎病毒(EAV)是馬病毒性動脈炎(EVA)的病原，EVA是各國馬匹進(jìn)出口檢疫中必檢的二類檢疫性傳染病。本研究在RK-13細(xì)胞上培養(yǎng)的馬動脈炎病毒在4℃、室溫和37℃條件下，用各種動物的紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn)，證實(shí)病毒在不同溫度下均可凝集小鼠和雞的紅細(xì)胞，但不能凝集牛、綿羊、山羊、馬、豬、豚鼠、倉鼠、兔及鵝紅細(xì)胞。病毒用吐溫-80和乙醚處理后，血凝活力會顯著增強(qiáng)，其血凝滴度比未經(jīng)處理的病毒高4～8倍，且血凝像更加清晰。最適處理?xiàng)l件是病毒

2、在冰浴狀態(tài)下用終濃度0.06～0.125％(V／V)吐溫．80振蕩處理15～60 min，再加50％(V／V)乙醚振蕩作用5～15min。用EAV免疫SPF豚鼠，4周后采血做HI和NT試驗(yàn)，顯示HI抗體和NT抗體產(chǎn)物成正相關(guān)。對550份來自新西蘭、吉爾吉斯、內(nèi)蒙古、新疆的馬血清做EAV的抗體檢測。比較兩個試驗(yàn)，二者符合率為97.8％，，血凝抑制抗體與中和抗體效價呈顯著的正相關(guān)，抗體效價也略低于后者。 參照美國的馬病毒性動脈炎(E

3、VA)診斷技術(shù)，確立了EAV在RK-13細(xì)胞上生長的最適條件，制備了EAV標(biāo)準(zhǔn)株Bueyrus高免血清，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用馬動脈炎病毒(EAV)標(biāo)準(zhǔn)種毒和EAV標(biāo)準(zhǔn)陽性、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清， 建立了檢測EAV抗體的微量血清中和試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)馬傳貧陽性血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。應(yīng)用建立的中和試驗(yàn)方法對進(jìn)出口的9121頭份馬血清抗體檢測，有305頭血清抗體滴度達(dá)1:4～1:128。用自制的瓊擴(kuò)抗原進(jìn)行比較試驗(yàn)，只檢出68頭份血清樣品為EAV

4、抗體陽性，微量中和試驗(yàn)比瓊擴(kuò)試驗(yàn)敏感性高。 選取EAV病毒基因組中高度保守的開放閱讀框7(ORF7)序列，設(shè)計(jì)了特異性引物和Taqman探針，利用一步法的實(shí)時定量RT-PCR來定量檢測EAV。使用含有選定檢測序列的克隆標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，證明該方法可從組織培養(yǎng)液(TCF)中檢出含有5PFU／100μL病毒拷貝。對馬皰疹病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等無交叉反應(yīng)，特異性好。用疫苗用種毒(Bucyrus標(biāo)準(zhǔn)株)肌肉注射小馬后，定量RT-

5、PCR比病毒分離試驗(yàn)更能靈敏地檢出呼吸道排出的病毒。經(jīng)對456份臨床鼻腔分泌物樣品檢測結(jié)果，定量RT-PCR檢出6份陽性，而病毒分離只檢出2份陽性。一步法實(shí)時定量RT-PCR檢測樣品中的馬病毒性動脈炎病毒，在快捷、準(zhǔn)確、方便和高通量方面優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA和細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離的檢測方法，因此可以作為檢測馬病毒性動脈炎(EVA)病毒有效的快速方法。 在分析馬動脈炎病毒GL蛋白抗原性的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對引物克隆GL蛋白一段 抗原

6、性較好的抗原域編碼基因。將克隆的基因插入pET-32a的Bam HI和Xho I之間構(gòu)建了GL蛋白主要抗原域原核表達(dá)載體pET-GLl。將pET-GLl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL(21)宿主菌后，對培養(yǎng)和表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了EAV GL蛋白主要抗原域的高效表達(dá)。免疫印跡試驗(yàn)表明獲得的表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。應(yīng)用His Bind親和層析柱純化重組EAV-GLl蛋白，以純化的重組GLl蛋白作為檢測抗原，初步建立了檢測馬動脈炎病毒抗體的iGLl-E