嵌合動脈炎病毒全長cDNA克隆的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、除馬動脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)外，動脈炎病毒科還包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、乳酸脫氫酶升高癥病毒(lactate dehydrogenase elevating virus，LDV)以及猴出血熱病毒(simian hemmorrhagic fever virus，SHFV)。動脈炎

2、病毒感染的宿主主要為馬和驢(EAV)、豬(PRRSV)、鼠(LDV)和非洲、亞洲一些種屬的猴(SHFV)。感染動物主要表現(xiàn)為無明顯臨床癥狀的持續(xù)性帶毒；另外，也可造成流產(chǎn)或致死性的出血性高熱。關(guān)于動脈炎病毒基因組RNA的復(fù)制、亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯、病毒顆粒組裝以及病毒致病機(jī)理等許多問題尚待研究。 本研究旨在通過建立EAV全長cDNA克隆，進(jìn)而通過構(gòu)建不同EAV或其它動脈炎病毒之間的嵌合cDNA克隆，進(jìn)而研究不同基因組區(qū)域

3、及其編碼產(chǎn)物在病毒復(fù)制過程中的作用，為進(jìn)一步剖析病毒遺傳組份的結(jié)構(gòu)與功能及其在致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 1、馬動脈炎病毒基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建及其序列分析 根據(jù)馬動脈炎病毒Bucyrus株全基因組序列(GenBank NO NC 002532)，設(shè)計并合成EAV特異引物，進(jìn)而應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分6段擴(kuò)增了EAV M9544株的全基因組cDNA。將擴(kuò)增的各個cDNA重疊片斷PE124、PE631、PE1854、PE519

4、1、PE61107、PE97Q分別克隆到載體pCR-Blunt Ⅱ-TOPO中，建立了EAV各擴(kuò)增片段的cDNA克隆。在擴(kuò)增5'末端時，引NotI酶切位點(diǎn)和T7啟動子序列；在基因組3'末段Poly(A)尾后引入XhoI酶切位點(diǎn)，后者供cDNA模板的線性化之用。將上述片斷在pCR BluntⅡ-TOPO中依次連接，最后克隆到質(zhì)粒pBluescript Ⅱ SK(+)中，獲得了EAV全長基因組cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明：該毒株

5、基因組全長為12704個核苷酸(不包括poly(A)尾)，與EAV北美譜系代表株Bucyrus株的同源性為99.1％：與歐洲譜系分離株同源性為85.5％。與Bucyrus株全長序列相比，M9544株EAV全長基因組中共有106個核苷酸變異，有兩個核苷酸位于5'UTR中，在編碼區(qū)中有68個核苷酸為沉默突變，另外的36個核苷酸相應(yīng)地導(dǎo)致編碼區(qū)內(nèi)36個氨基酸發(fā)生變異。本研究構(gòu)建了EAV M9544株基因組全長cDNA克隆pWEAV，為進(jìn)一步獲

6、取EAV感染性克隆并研究動脈炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。 2 動脈炎病毒復(fù)制過程結(jié)構(gòu)蛋白調(diào)控因子的初步研究 動脈炎病毒的基因組RNA復(fù)制、亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯、病毒顆粒包裝等病毒生命周期的調(diào)控機(jī)制，尤其是病毒編碼蛋白在其中所起的作用尚待進(jìn)一步研究。將所構(gòu)建的M9544株全長cDNA克隆pWEAV體外合成RNA后轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過免疫熒光和RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞及培養(yǎng)上清，結(jié)果均不能檢測到病毒的復(fù)

7、制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞病變(CPE)，說明pWEAV含有致死性變異位點(diǎn)。 為了查明pWEAV中關(guān)乎病毒復(fù)制調(diào)控的致死性變異位點(diǎn)，本研究將細(xì)胞適應(yīng)株感染性克隆pEAV030(Snijder博士提供)為骨架，將pWEAV基因組不同區(qū)域cDNA片段置換嵌合到pEAV030中，構(gòu)建了一系列pEAV030/pWEAV的嵌合cDNA克隆。 將后者體外轉(zhuǎn)錄RNA后轉(zhuǎn)染BHK-21，病毒拯救試驗表明，上文所提及106個變異核苜酸中，位于5'UT

8、R中的兩個核苷酸變異不影響病毒的感染性； 在ORF1編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中共有10個氨基酸的變異和ORF2-4編碼的結(jié)構(gòu)蛋白GP2-4中11個氨基酸變異也不影響病毒的感染性。 另一方面，發(fā)現(xiàn)在pWEAV克隆基因組片段1651nt-4264nt間(nsp2的N端年和nsp3 C端)的6個氨基酸中存在致死性變異位點(diǎn)。nsp2和nsp3中這些氨基酸變異影響了病毒基因組RNA復(fù)制和亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄。而下游嵌合克隆pEAVexb(以

9、pWEAV相應(yīng)序列替換pEAV030的11488nt-11901nt)能夠在BHK-21中進(jìn)行復(fù)制轉(zhuǎn)錄，但是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及多次傳代細(xì)胞中未出現(xiàn)CPE。 說明GP5中位點(diǎn)170 A→S氨基酸突變影響病毒復(fù)制的轉(zhuǎn)錄后(post-transcriptional)階段，可能阻斷了病毒顆粒組裝以及出芽等病毒復(fù)制步驟。在pEAVxx(以pWEAV相應(yīng)序列替換pEAV030的11948nt-12704nt)N蛋白位點(diǎn)56 H→Y位點(diǎn)為病毒感染

10、性致死性變異位點(diǎn)；通過對pEAVxx進(jìn)行回復(fù)突變(Y→H)獲得了拯救病毒，說明該氨基酸對病毒轉(zhuǎn)錄后的翻譯、病毒顆粒包裝或出芽等步驟可能起調(diào)控作用。 總之，通過利用無感染性的M9544株與感染性克隆pEAV030進(jìn)行嵌合，我們發(fā)現(xiàn)了28個氨基酸變異不影響EAV的復(fù)制過程：而另一方面，nsp2的N端和nsp3C端中6個氨基酸變異影響病毒基因組RNA復(fù)制和亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄過程。而GP5和N蛋白中兩個位點(diǎn)對病毒基因轉(zhuǎn)錄后階段起著重要的

11、調(diào)控作用。 3、Nsp6在動脈炎病毒復(fù)制中的作用 動脈炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1-13)裝配成所謂的“復(fù)制轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體”(Replicase/Trsllscriptiase Complex，RTC)，后者是動脈炎病毒基因組RNA復(fù)制及亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄等過程的引擎。目前對各個nsp在RTC中所起的作用及機(jī)制并不清楚，其中，nsp6作為已知最小的nsp(13-22aa)，其結(jié)構(gòu)和功能有待研究。為了研究nsp6在動脈炎病

12、毒復(fù)制中的作用，本研究通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)法對PRRSV全長感染性克隆pAPRRS的nsp6(16aa)進(jìn)行了系列缺失，同時與其它動脈炎病毒的nsp6進(jìn)行替換，構(gòu)建了一系列以pAPPRS為骨架的全長cDNA克隆突變體。病毒拯救試驗表明，nsp6全部(16)或部分(3、6個)氨基酸缺失的突變體不能產(chǎn)生病毒，但RT-PCR結(jié)果顯示突變體能夠進(jìn)行亞基因組的轉(zhuǎn)錄，說明nsp6對病毒的轉(zhuǎn)錄是非必需的。歐洲型PRRSV nsp6和p

13、APRRS的nsp6之間存在3個氨基酸差異，用前者替換的嵌合克隆能夠被拯救出相應(yīng)的嵌合病毒，說明上述三個氨基酸序列不具有型間特異性；將LDV nsp6替換pAPRRS nsp6，改變了nsp6中的6個氨基酸，RT-PCR和IFA能夠檢測到嵌合克隆基因組RNA和亞基因組RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，但是不能產(chǎn)生CPE。 EAV nsp6(22aa)替換pAPRRS nsp6后改變整個APRRS nsp6的結(jié)構(gòu)，嵌合克隆未被檢測到復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

14、 綜上所述，本研究表明，nsp6對動脈炎病毒的感染性是必需的，其作用機(jī)制尚待研究；另一方面，我們發(fā)現(xiàn)其中三個氨基酸變異不影響了病毒復(fù)制過程，而更大幅度的突變在更大程度上影響了病毒的復(fù)制過程，RNA合成翻譯甚或病毒顆粒成熟過程。 4、強(qiáng)弱毒株P(guān)RRSV嵌合感染性克隆的構(gòu)建及鑒定 PRRSV是近兩年來流行于我國大部分省份的“豬高熱綜合征”的主要病原體。該病毒在增殖過程中極易發(fā)生遺傳及抗原變異。查明PRRSV致病性大幅增高的

15、機(jī)制，進(jìn)而研制用于防治易變的流行PRRSV變異株的高效疫苗無疑是獸醫(yī)工作者的當(dāng)務(wù)之急。在弱毒株APRRS的全長感染性克隆pAPRRS及其含有多克隆位點(diǎn)(PacI，SwaI，AscI)的突變感染性克隆pCSA以及我室構(gòu)建的高致病(high pathogencity，HP)PRRSV感染性克隆pJX143的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列包括PRRSV ORF1a、ORF1b以及ORF2-7等的強(qiáng)弱毒PRRSV嵌合感染性克隆。將構(gòu)建的嵌合克隆轉(zhuǎn)染Mar