柴胡全長cDNA文庫和遺傳圖譜的構建及蠶豆病毒屬病毒的鑒定.pdf

1、柴胡為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum L.)植物,具有解表合里、疏肝解郁、升舉陽氣之功效,是我國重要的藥用植物。本研究構建柴胡(B.chinense DC.)全長cDNA文庫,并從cDNA文庫中隨機挑選了3902個單克隆進行5’端測序,挖掘SSR位點,并在對文庫測定序列的分析研究過程中,發(fā)現(xiàn)了與蠶豆萎蔫病毒2(Broad bean willvirus2.BBWV-2)同源性很高的克隆,推測構建柴胡文庫的試料

2、可能被BBWV-2侵染。因此,利用RT-PCR和指示植物接種方法,鑒定了侵染柴胡的病毒。最后,利用ISSR和開發(fā)的SSR分子標記構建柴胡分子遺傳圖譜。為進一步開展柴胡功能基因組學及柴胡分子標記輔助育種等研究奠定基礎。試驗主要結果如下:
　　 (1)利用SMART技術構建了柴胡根全長cDNA文庫。從文庫中隨機選擇了3902個克隆進行5’端單反應測序,獲得了3111個高質量cDNA序列,包括377個序列重疊群和1273個單一序列共1

3、650個獨立基因。文庫插入片段平均長度約1.1 kb,全長比率約51.5％。
　　 (2)利用BlastX分析結果表明949(57.5％)個獨立基因和已鑒定基因同源,680(41.2％)個獨立基因與GenBank中未知、未命名或推測的蛋白基因同源,21個獨立基因沒有找到同源基因。
　　 (3)在1650個獨立基因中82個含有SSR位點,其中4個獨立基因有兩個SSR位點,共挖掘了86個SSR位點,為柴胡遺傳圖譜的構建,遺傳

4、多樣性的分析及種質鑒定提供有效的分子標記。
　　 (4)在對文庫測定序列的分析研究過程中,發(fā)現(xiàn)重疊群45與BBWV-2病毒的核酸序列有很高的同源性,推測構建柴胡文庫的試料可能被BBWV-2侵染。
　　 (5)首次在柴胡上發(fā)現(xiàn)了蠶豆萎蔫病毒2的侵染,利用檢測蠶豆病毒屬不同種的特異引物對染病柴胡進行了RT-PCR鑒定。并將染病柴胡上的病毒機械接種到莧色藜(Chenopodium Amaranticolor)指示植物上。結果證

5、實了侵染柴胡的病毒為BBWV-2。
　　 (6)ISSR和SSR分子標記的多態(tài)性:經父母本多態(tài)性篩選,從30條ISSR和44對SSR引物中篩選出28條ISSR和14對SSR多態(tài)性引物,擴增出168條多態(tài)性條帶,其中有36個位點表現(xiàn)偏分離,頻率為21.4％。
　　 (7)遺傳圖譜的構建:通過對F1代進行基因型和連鎖分析,初步構建了包含13個連鎖群,80個(72個ISSR和8個SSR)位點的首張北柴胡遺傳圖譜。該圖譜覆蓋長度