新城疫病毒HN蛋白頭部保守氨基酸定位和功能研究及全長cDNA的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　副粘病毒(paramyxovirus)屬于單股負(fù)鏈RNA(-ssRNA)病毒。副粘病毒科（Paramyxoviridae）可分為兩個(gè)亞科:副粘病毒亞科Par amyxo virinae）和肺病毒亞科(Pneumovirinae)。副粘病毒亞科包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)、麻疹病毒屬(Morbillivirus)和腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，副粘病毒屬的主要成員有副流感病毒(parainf

2、luenza virus，PIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)和仙臺病毒（Sendai Virus，SeV），其中PIV和NDV是副粘病毒的典型代表;麻疹病毒屬只包括一種病毒即麻疹病毒(measles virus，MV)，并且只能感染人類;腮腺炎病毒屬的代表性成員是流行性腮腺炎病毒(mumps virus，MuV);肺病毒亞科包括肺病毒屬，主要有呼吸道合胞病毒(respiratory syncy

3、tial virus，RSV)和禽肺病毒(avian pneumovirus，APV)。近年來又新發(fā)現(xiàn)了一些副粘病毒的成員，如亨德拉病毒(Hendra virus， HeV)、尼帕病毒(Nipah virus， NiV)、人類偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）。副粘病毒可以感染人類、哺乳動物和多種禽類，主要引起呼吸系統(tǒng)的感染性疾病，除此之外，還能引起生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病。
　　副粘病

4、毒的形態(tài)類似于與流感病毒，但其病毒顆粒的體積稍大于流感病毒，病毒顆粒一般為球形，也可以呈現(xiàn)多形性，直徑約150～300nm。副粘病毒的基因組大小在13～16kb之間，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。典型的副粘病毒基因組包含6個(gè)基因，分別對應(yīng)6個(gè)開放讀碼框（open reading frame，ORF），從病毒的3'端開始分別編碼衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin

5、-neuraminidase，HN)和大分子蛋白(L)蛋白(3'-NP-P-M-HN-F-L-5')，每個(gè)ORF之間存在非編碼序列和調(diào)控序列。其中，NP、P和L蛋白構(gòu)成RNA依賴的RNA聚合酶復(fù)合體(RNAdependentRNA polymerase，RDRP)，在病毒感染宿主細(xì)胞后合成病毒的mRNA;M蛋白能夠與NP、HN和F蛋白相結(jié)合，在病毒粒子的裝配及出芽過程中起到重要作用;HN和F蛋白是兩種位于病毒包膜表面的糖蛋白，其中吸附蛋

6、白(HN)在副粘病毒的不同成員中具有不同的生物學(xué)功能，根據(jù)其功能不同，命名有所不同，如在NDV和hPIV中，吸附蛋白同時(shí)具有血吸附（HAD）和NA活性，被稱為HN蛋白;在MV中，吸附蛋白只有HAD而不表現(xiàn)出NA活性，因此將其命名為H蛋白;在NiV和HeV中，吸附蛋白既無HAD能力，又無NA活性，此時(shí)稱之為G蛋白。F蛋白能夠介導(dǎo)病毒包膜-細(xì)胞膜和細(xì)胞膜-細(xì)胞膜之間的融合，是病毒感染和致病的重要蛋白。在副粘病毒中，絕大多數(shù)成員的F蛋白(SV

7、、NiV和HeV例外)，需要同源的吸附蛋白的激活才能啟動膜的融合過程。
　　目前研究認(rèn)為，首先HN蛋白與細(xì)胞膜表面的唾液酸(sialic acid)受體結(jié)合，HN蛋白將某種信號傳遞至其頸部區(qū)域，隨后HN蛋白的頸部和F蛋白發(fā)生相互作用，將某種激活信號傳遞至F蛋白，F(xiàn)蛋白發(fā)生二硫鍵的重排使其構(gòu)象發(fā)生改變，原本包埋在F蛋白內(nèi)部的融合肽暴露并插入到細(xì)胞膜中，F(xiàn)蛋白發(fā)生內(nèi)部的β片層和α螺旋之間的轉(zhuǎn)換，重新折疊形成一種6聚體的束狀結(jié)構(gòu)(6HB

8、)，使病毒包膜和細(xì)胞膜足夠接近，形成融合小孔，最終完成融合的過程。在這個(gè)過程中HN蛋白與受體結(jié)合是激活整個(gè)事件的關(guān)鍵步驟，本研究擬在以前研究的基礎(chǔ)上，針對NDV HN蛋白頭部的保守氨基酸(aa)，構(gòu)建突變體，并構(gòu)建頭部缺失的NDV HN突變體，通過檢測其功能的改變，弄清HN蛋白頭部保守aa對HN多種生活學(xué)功能的影響和HN蛋白在促細(xì)胞融合過程中所起到的作用和機(jī)制。
　　研究目的：
　　通過觀察HN蛋白頭部區(qū)域高度保守的aa突變

9、后蛋白功能的變化，定位HN頭部的關(guān)鍵aa;根據(jù)突變體受體結(jié)合能力、NA和促細(xì)胞融合活性改變程度的變化，分析這些關(guān)鍵的aa位點(diǎn)對其生物學(xué)功能的影響，闡述HN蛋白三種功能間的關(guān)系和HN蛋白頭部和頸部在激活F蛋白過程中的作用;通過研究NDV HN頭部缺失突變體的促細(xì)胞融合功能來研究NDV HN頸部在促細(xì)胞融合過程中的作用。
　　研究方法：
　　1.NDV HN頭部保守aa突變體構(gòu)建:比對NDV、hPIV3、MV、SeV、HeV和N

10、iV吸附蛋白序列，確定NDV HN蛋白頭部3組高度保守的aa，分別為:E401、G402、R403、G468、V469、Y470、Y526、T527和T528，通過定點(diǎn)突變的方法將上述aa突變?yōu)楸彼?A);
　　2.突變體的表達(dá):利用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent將含突變HN基因的質(zhì)粒和野毒株(wt)F質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，利用痘苗病毒-T7瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)各個(gè)突變體;<

11、br>　　3.突變體表達(dá)效率的檢測:NDV HN頭部突變體的定性表達(dá)情況由簡介免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IIFA)檢測;利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)技術(shù)分析NDV HN頭部突變體在細(xì)胞膜表面的表達(dá)效率;
　　4.蛋白功能的檢測:在細(xì)胞表面表達(dá)NDV HN突變體后HAD試驗(yàn)定性和定量測定各突變體的受體結(jié)合能力;利用R18熒光探針標(biāo)記的鴿紅細(xì)胞與共表達(dá)突變體HN和野毒株(wt)F蛋白的細(xì)胞進(jìn)行半融合試驗(yàn)，檢測NDV HN突變體在促細(xì)胞融合的啟動過程

12、當(dāng)中的速率改變和合胞體形成情況;Giemsa染色對各個(gè)NDV HN頭部突變體引起的細(xì)胞融合現(xiàn)象進(jìn)行定性觀察，并且利用指示基因法(report gene method)定量測定各個(gè)突變體的促細(xì)胞融合功能;NDV HN突變體與β-半乳糖苷酶底物反應(yīng)后，利用比色法定量測定突變體的NA活性;
　　5.構(gòu)建HN蛋白頭部缺失的NDV HN突變體，分別在37℃和39.5℃的條件下共轉(zhuǎn)染野毒株F蛋白，Giemsa染色觀察NDV HN頭部缺失突變體

13、介導(dǎo)的合胞體形成情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.突變體E401A、G402A、R403A、G468A、V469A、Y470A、Y526A、T527A和T528A突變體均構(gòu)建成功。FACS分析表明突變體E401A、G402A、G468A、 V469A、Y526A和T527A表達(dá)成功，其細(xì)胞表面的表達(dá)效率分別為wt的69.3％、101.4％、94.6％、92.0％、84.1％和102.9％;而突變體R403A、Y470A和T52

14、8A通過IIFA和FACS分析均未檢測到在細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)部的表達(dá);
　　2.NDV HN蛋白的功能檢測結(jié)果顯示，E401A和Y526A突變體的HAD活性基本消失，降低到wt的7.3％和7.9％，其NA降低到了wt的10.1％和0.4％，促細(xì)胞融合活性降低到了wt的2.4％和3.2％; G402A和T527A性突變體的HAD活為wt的71.5％和49.2％，與其神經(jīng)氨酸酶和促細(xì)胞融合活性的下降程度相當(dāng)，分別為72.8％，35.5

15、％和53.4％和54.2％; G468A的HAD基本沒有下降，為wt的93.9％，而其NA下降到了wt的35.3％，促細(xì)胞融合活性下降至wt的70.0％，其NA的下降程度遠(yuǎn)大于HAD活性和促細(xì)胞融合活性下降的幅度;與之不同的是V469A突變體的HAD活性為wt的46.5％，NA為wt的68.1％，而促細(xì)胞融合活性降低到了wt的12.4％，其促細(xì)胞融合活性的下降程度遠(yuǎn)大于HAD活性和NA下降的幅度;
　　3.HN和F蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)

16、結(jié)果為:第一，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合的程度與HN和F蛋白的相互作用程度成反比，E401A和Y526A突變體仍與F蛋白有較強(qiáng)的相互作用，而HAD活性幾乎沒有下降的G468A突變體與F蛋白的相互作用則較弱;第二，用R18標(biāo)記豚鼠紅細(xì)胞后，與共表達(dá)NDV HN和F蛋白的細(xì)胞在37℃條件下的融合速率未發(fā)生明顯變化，但是形成合胞體的數(shù)目和直徑均小于wtHN和F蛋白共表達(dá)實(shí)驗(yàn)組;
　　4.頭部缺失的NDV HNs與同源的F蛋白共表達(dá)時(shí)，

17、在37℃和39℃時(shí)均出現(xiàn)了合胞體，但是合胞體的數(shù)目和直徑均小于wt的HN和F蛋白共表達(dá)實(shí)驗(yàn)組。
　　研究結(jié)論:
　　1.E401和Y526位點(diǎn)是NDV HN頭部區(qū)域有關(guān)受體結(jié)合的關(guān)鍵aa，其突變導(dǎo)致受體結(jié)合活性的喪失;E401A和Y526A突變體所引起的神經(jīng)氨酸酶和促細(xì)胞融合活性的消失是因?yàn)槭荏w無法結(jié)合所導(dǎo)致的;
　　2.G402和T527位點(diǎn)其突變導(dǎo)致HN受體結(jié)合能力、NA和促細(xì)胞融合活性的相應(yīng)降低，但是仍能夠引起細(xì)