副粘病毒HN糖蛋白功能性關鍵氨基酸定位與促細胞融合機制研究.pdf

1、第一部分:
　　 新城疫病毒HN糖蛋白HR區(qū)域α位氨基酸和N481糖基化位點突變后降低細胞融合和HN-F蛋白相互作用的機制
　　 研究背景:
　　 新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為單股負鏈不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，能引起家禽發(fā)生新城疫(Newcastledisease，ND)。ND是一種主要累及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，進展迅速并且危害最為嚴重的家禽傳染病。人

2、類可因接觸病禽和活毒疫苗而引起結膜炎或淋巴腺炎。目前對ND缺乏有效的免疫防治措施，其研究障礙是對病毒與宿主細胞的相互作用過程尚不清楚，因此必須弄清NDV與宿主細胞的相互作用機制。NDV是副粘病毒的典型代表，往往被作為副粘病毒的研究模型。
　　 細胞膜融合是NDV增殖與感染的關鍵步驟，也是感染細胞的典型病例特征。此過程主要由NDV包膜上的血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidaseprotein，

3、HN）和融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn))協(xié)同完成，提示HN與F蛋白存在相互作用區(qū)域，并且與F蛋白的發(fā)生相互作用區(qū)域可能位于HN蛋白的莖部。目前NDV的HN與F蛋白的相互作用機制尚未完全明了。在NDV的HN蛋白莖部區(qū)域內包含兩個七肽重復區(qū)域(hepadrepeatregions，HR)，分別是HR1(74～88aa)和HR2(96～110aa)，每一個HR形成的α-螺旋結構可能參與HN與F蛋白的相互作用，L74、V81和V88是

4、HR1內的α位點氨基酸，L96、I103和L110是HR2內的α位點氨基酸。有研究表明HR區(qū)域內α位點的氨基酸突變對HN蛋白的功能有重要影響，但是否會影響HN與F蛋白的相互作用未見報道。
　　 N-糖基化對NDVHN蛋白的折疊加工和功能都有重要影響。NDV的HN蛋白含有6個潛在的糖基化位點，只有4個潛在的糖基化位點即N119、N341、N433和N481存在N-糖基化，N-糖鏈的缺失影響NDV的毒力，但是否會影響HN與F蛋白的相

5、互作用尚未可知。
　　 研究目的:
　　 研究NDVHN蛋白的HR區(qū)域內α位點氨基酸和N-糖基化位點氨基酸的功能，闡明NDV的HN蛋白促細胞融合及HN與F蛋白的相互作用機制，為有針對性地設計抗NDV感染的疫苗奠定基礎。
　　 研究方法:
　　 1.NDV的HN蛋白突變體構建及轉染:利用融合PCR與體內同源重組相結合的方法構建α位氨基酸和N-糖基化位點突變體，經(jīng)測序后確定突變位點。應用Lipofectami

6、neTM2000將空載體、HN的野生型、各突變體質粒轉染或者和F蛋白質粒共轉染預感染的重組痘苗病毒vTF7-3的BHK-21細胞系。
　　 2.放射免疫沉淀以及放射免疫共沉淀:放射免疫沉淀是利用EXPRE35S35S復合物標記總的HN和F蛋白，一半蛋白沉淀物不做處理，另一半蛋白沉淀物經(jīng)糖苷酶PNGaseF酶切;放射免疫共沉淀是分別利用EXPRE35S35S復合物和sulfo-NHS-SS-biotin標記細胞表面的HN和F蛋白，

7、都采用還原條件下的10％SDS-PAGE進行凝膠電泳，運用PerkinElmerCyclonePlus軟件分析。
　　 3.各突變株蛋白細胞表面表達效率及活性測定:流式細胞儀分析細胞表面各突變株蛋白表達效率，Giemsa染色和指示基因法分別定性和定量測定其促細胞融合活性，血吸附法測定其受體結合活性，比色分析法測定其神經(jīng)氨酸酶活性。
　　 4.統(tǒng)計學方法:用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以(x)±s表示，應用

8、t檢驗對突變株HN蛋白與野生型HN蛋白的測定結果進行比較，P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果:
　　 1.NDV的HN蛋白HR區(qū)域內6個α位氨基酸突變體構建成功，分別是L74A、V81A、V88A、L96A、I103A和L110A，它們的促細胞融合活性都有不同程度的降低，分別占野毒株的22.6％、29.9％、24.7％、70.4％、9.1％和17.8％。與F蛋白的相互作用能力減弱，各突變株的細胞表面蛋白表達

9、效率與野毒株相比差別均無統(tǒng)計學意義。除L96A的受體結合活性與野毒株大體一致外，其它突變株的受體結合活性都降低，I103A的受體結合活性降低最多，占野毒株的28.2％。L74A、V81A和L96A的神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株大體一致，V88A也保持了野毒株HN蛋白78.5％的活性，I103A和L110A的神經(jīng)氨酸酶活性僅為野毒株的5.7％和5.2％。
　　 2.NDV的HN蛋白4個N-糖基化位點突變體構建成功，分別為N119A、N3

10、41A、N433A和N481A,4個糖基化位點突變株的電泳速率較野毒株的電泳速率增快。經(jīng)糖苷酶PNGaseF酶切之后，各突變株與野毒株的電泳速率一致，N481A蛋白沉淀量較少。流式細胞術檢測N481A的細胞表面蛋白表達率僅為野毒株的57.5％，而其他3個糖基化位點突變株的細胞表面蛋白表達率與野毒株相比差別無統(tǒng)計學意義。N119A、N341A和N433A仍然保持著和野毒株大體一致的促細胞融合活性，然而N481A的促細胞融合活性降低為野毒株

11、的66.2％。放射免疫共沉淀結果顯示N481A與F蛋白的相互作用能力降低為野毒株的53.6％，而其他3個糖基化位點突變株與F蛋白相互作用能力與野毒株相比差別無統(tǒng)計學意義。N481A的受體結合活性和神經(jīng)氨酸酶活性都明顯降低，分別為野毒株的33.4％和6.5％，N119A和N341A突變株的受體結合活性和神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株相比差別無統(tǒng)計學意義，N433A的受體結合活性略有升高，而神經(jīng)氨酸酶活性降低為野毒株的70.0％。
　　 結

12、論:
　　 1.含有HR區(qū)域內α位氨基酸突變的HN蛋白的促細胞融合活性的減少和HN蛋白的突變株與F蛋白的相互作用能力的降低有關，但兩者之間不成正比例。
　　 2.含有HR區(qū)域內α位氨基酸突變的HN蛋白的受體結合活性、神經(jīng)氨酸酶活性和HN蛋白的突變株與F蛋白相互作用能力是一個平衡的網(wǎng)絡，共同調控著HN蛋白的促細胞融合活性。
　　 3.NDV的HN蛋白HR區(qū)域α位氨基酸和N481位點突變后干擾細胞融合和HN與F蛋白相

13、互作用的機制不同。第481位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼岷髮е翲N蛋白折疊和加工異常，從而影響促細胞融合活性及HN與F蛋白的相互作用能力。而HR區(qū)域內α位氨基酸突變后可能導致關于激活F蛋白的信號從HN蛋白頭部到莖部區(qū)域的傳導過程中出現(xiàn)變化，導致促細胞融合活性及HN與F蛋白的相互作用能力都降低。
　　 第二部分:
　　 人副流感病毒3型HN蛋白保守氨基酸突變分析
　　 研究背景:
　　 人副流感病毒(humanp

14、arainfluenzaviruses，hPIV)為副粘病毒科副粘病毒屬的主要成員之一，是一類引起嬰幼兒肺炎和下呼吸道疾病的重要病原體。hPIV分為1～4型，其中人副流感病毒3型（humanparainfluenzavirustype3，hPIV-3）不僅引起的疾病最嚴重，而且此型病毒檢出率也最高。但hPIV-3感染宿主細胞的機制卻并不清楚。
　　 hPIV-3感染宿主細胞周期包括吸附、穿入、脫殼、病毒基因組及蛋白質的合成、子代

15、病毒顆粒的裝配及釋放等步驟。hPIV-3與宿主細胞膜的融合包括吸附、穿入和脫殼整個連續(xù)的過程。這一融合過程不僅是hPIV-3感染機體的第一道關口，也是病毒完成生命周期的關鍵步驟和抗病毒藥物的主要作用靶點。hPIV-3的表面鑲嵌著HN和F糖蛋白，HN糖蛋白必須通過識別并結合宿主細胞膜表面的唾液酸受體，激活F糖蛋白前體F0裂解為F1和F2，啟動膜融合過程。
　　 N-糖基化是hPIV-3的HN糖蛋白的一種重要的翻譯后修飾。宿主細胞膜

16、表面的內源性凝集素受體和糖鏈結合蛋白都能與hPIV-3HN蛋白的N-糖鏈結合并幫助病毒順利介導膜融合過程，暗示N-糖鏈在hPIV-3誘導膜融合的過程中發(fā)揮重要作用。到目前為止，并沒有關于hPIV-3HN蛋白N-糖鏈功能的研究報道。
　　 hPIV-3的HN蛋白含有兩種受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點，即Ⅰ型和Ⅱ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點。R192、D216、E409、R424、R502、Y530和E549是位于Ⅰ型受體結合/神經(jīng)

17、氨酸酶活性位點內的保守氨基酸，N551和H552為Ⅱ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點內的保守氨基酸。NDV的HN蛋白的Ⅰ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點對神經(jīng)氨酸酶和促細胞融合活性具有重要作用，而Ⅱ型受體結合活性/神經(jīng)氨酸酶活性位點只對受體結合活性有重要作用，但Ⅱ型位點不是神經(jīng)氨酸酶活性位點。我們推測hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型和Ⅱ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點可能具有與NDV相似的功能。
　　 hPIV-3的HN蛋白氨基酸序列含有一

18、段六縮氨酸NRKSCS(252～257aa)，與第二個β折疊結構相連，此區(qū)域是副粘病毒受體結合蛋白（HN、H和G蛋白）內最長的一段保守氨基酸序列，從hPIV-3的HN蛋白晶體結構分析發(fā)現(xiàn)此區(qū)域距離受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點很近，我們推測可能對HN蛋白的受體結合和神經(jīng)氨酸酶活性有著重要作用。
　　 對副粘病毒受體結合蛋白的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)hPIV-3的HN蛋白氨基酸序列除了含有最長的一段NRKSCS保守六縮氨酸外，還包含

19、保守三縮氨酸EGR(409～411)、GVV(476～478)和YTT(530～532)，分別位于HN蛋白的第四、第五和第六β折疊結構內。EGR和YTT三縮氨酸位于HN蛋白的受體結合口袋附近，其中E409和Y530也是Ⅰ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點內的保守氨基酸，β折疊結構的三縮氨酸在副粘病毒科內的受體結合蛋白中具有保守性，暗示三縮氨酸的結構對HN蛋白的功能可能具有重要作用。
　　 研究目的:
　　 1.確定hPIV-

20、3的HN蛋白的N-糖基化位點及受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中保守氨基酸的功能和關鍵氨基酸;
　　 2.確定hPIV-3的HN蛋白的六縮氨酸和三縮氨酸的功能和關鍵氨基酸;
　　 3.闡明hPIV-3HN蛋白的促細胞融合及HN與F蛋白的相互作用機制。
　　 研究方法:
　　 1.hPIV-3HN蛋白突變體的構建及轉染:利用融合PCR與體內同源重組相結合的方法構建單個和聯(lián)合突變體，經(jīng)測序最終確定突變位點。應用L

21、ipofectamineTM2000將空載體、HN的野生型、各突變體質粒轉染或者和F蛋白質粒共轉染預感染的重組痘苗病毒vTF7-3的BHK-21細胞系。
　　 2.放射免疫沉淀以及放射免疫共沉淀:放射免疫沉淀是利用EXPRE35S35S復合物標記總的HN和F蛋白，一半蛋白沉淀物不做處理，另一半蛋白沉淀物經(jīng)糖苷酶PNGaseF酶切，放射免疫共沉淀是分別利用EXPRE35S35S復合物和sulfo-NHS-SS-biotin標記細胞

22、表面的HN和F蛋白，都采用還原條件下的10％SDS-PAGE進行凝膠電泳，運用PerkinElmerCyclonePlus軟件分析。
　　 3.各突變株蛋白細胞表面表達效率及活性測定:流式細胞儀分析各突變株的細胞表面蛋白表達效率，Giemsa染色和指示基因法分別定性和定量測定其促細胞融合活性，血吸附法測定其受體結合活性，比色分析法測定其神經(jīng)氨酸酶活性，R18探針標記法測定其半融合活性。
　　 4.細胞膜融合動態(tài)測定:應用

23、R18探針標記人紅細胞膜，加入已經(jīng)轉染目的質粒的BHK-21細胞中，熒光光度計測定0～300S的熒光光度值，繪制動態(tài)曲線記錄細胞膜融合的動態(tài)變化。
　　 5.統(tǒng)計學方法:用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以（x）±s表示，應用t檢驗對突變株與野毒株的測定結果進行比較，P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果:
　　 1.hPIV-3的HN蛋白糖基化位點突變體的構建及功能測定
　　 4個

24、糖基化位點單個突變體G1、G2、G3和G4及四個聯(lián)合突變體G12、G14、G24和G124構建成功。G1、G2、G4、G12、G14、G24和G124的電泳速率比野毒株稍快，G3的電泳速率與野毒株一致，各突變株蛋白經(jīng)PNGaseF酶切后，其電泳速率與野毒株都一致。hPIV-3的HN蛋白N-糖基化位點的缺失導致其促細胞融合活性的減少和受體結合活性降低（P＜0.05），但不影響細胞表面蛋白表達效率、神經(jīng)氨酸酶活性及HN與F蛋白的相互作用能力

25、，但聯(lián)合突變株不能完全激活共轉染的F蛋白的有效裂解。N-糖基化位點的缺失抑制了半融合活性和促進F蛋白啟動細胞融合能力。
　　 2.hPIV-3的HN蛋白受體結合位點內保守氨基酸突變體的構建及功能測定
　　 hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中的7個保守氨基酸突變體R192A、D216A、E409A、R424A、R502A、Y530A和E549A，以及Ⅱ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中2個保守氨基酸突變

26、體N551A和H552A都構建成功。除了N551A的促細胞融合活性略有升高（為野毒株的112.2％）外，其他突變株都有不同程度的降低。各突變株表面蛋白表達率都為野毒株的90％以上，并且差別均無統(tǒng)計學意義。HN蛋白的受體結合位點/神經(jīng)氨酸酶活性位點中保守氨基酸突變對HN與F蛋白的相互作用并沒有影響，但E409A、R424A、R502A和H552A促進F蛋白裂解的能力分別降低為野毒株的54.8％、46.3％、56.3％和43.4％。除N55

27、1A受體結合活性與野毒株大體一致（為野毒株的100.1％）外，各突變株的受體結合活性均有不同程度降低(P＜0.05)。E549A和N551A的神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株相比差別均無統(tǒng)計學意義，而其他突變株蛋白與野毒株相比有不同程度的降低（P＜0.05）。除N551A外其它突變株的半融合活性和促進F蛋白啟動細胞膜融合能力有不同程度的降低。
　　 3.hPIV-3的HN蛋白六縮氨酸突變體的構建及功能測定
　　 hPIV-3的HN

28、蛋白六縮氨酸突變體N252、R253、K254、S255、C256和S257構建成功。各突變株細胞表面蛋白表達效率與野毒株相比差別均無統(tǒng)計學意義。各突變株與F蛋白的相互作用能力與野毒株相比差別無統(tǒng)計學意義。N252A、R253A、K254A和C256A促進F蛋白裂解的能力分別降低為野毒株的59.1％、17.3％、65.0％和13.2％。S257A的促細胞融合、受體結合和神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株大體一致，其它各突變株的促細胞融合、受體結合和

29、神經(jīng)氨酸酶活性均有不同程度降低(P＜0.05)。除S257A外，其它突變株蛋白的半融合活性和促進F蛋白啟動細胞膜融合的能力都有不同程度的降低。
　　 4.hPIV-3的HN蛋白三縮氨酸突變體的構建及功能測定
　　 hPIV-3的HN蛋白三縮氨酸各突變體E409A、G410A、R411A、G476A、V477A、Y478A、Y530A、T531A和T532A都構建成功。各突變株蛋白的促細胞融合活性都有不同程度的降低(P＜0

30、.05)。突變株細胞表面的蛋白表達效率及其與F蛋白的相互作用能力差別均無統(tǒng)計學意義。E409A、R411A、G476A、V477A、Y478A和H552A促進F蛋白裂解的能力分別降低為野毒株的54.8％、35.5％、35.5％、31.4％、29.8％和11.8％。各突變株的受體結合活性、神經(jīng)氨酸酶活性、半融合活性和促進F蛋白啟動細胞膜融合的能力均有不同程度降低（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1.hPIV-3HN蛋

31、白的N308、N351和N5233個潛在的糖基化位點確實被N-糖基化修飾。
　　 2.N-糖基化位點單個突變和聯(lián)合突變后HN蛋白的受體結合和促細胞融合活性都有不同程度的降低，兩者降低程度成正比。
　　 3.hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中的保守氨基酸對HN蛋白的促細胞融合活性起著重要作用，第502位精氨酸(R)是關鍵氨基酸。
　　 4.第552位組氨酸(H)是Ⅱ型受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位

32、點內的關鍵氨基酸。
　　 5.六縮氨酸NRKSCS是hPIV-3HN蛋白受體結合/神經(jīng)氨酸酶活性位點的組成部分，并且此區(qū)域內除S257外的氨基酸突變會降低HN蛋白的促細胞融合活性，第253位精氨酸(R)是六縮氨酸的關鍵氨基酸。
　　 6.三縮氨酸對hPIV-3的HN蛋白促細胞融合活性有重要影響，其中T532為保守三縮氨酸內的關鍵氨基酸。
　　 7.hPIV-3的HN蛋白與受體結合前后始終與F蛋白結合在一起形成HN