抗體壓下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白關(guān)鍵抗原表位氨基酸的變異分析.pdf

1、禽流感病毒(Avian Influenza Virus AIV)為正粘病毒科(Orthomxoviridae)，流感病毒屬(Influenzavirus)，單鏈負股分節(jié)段RNA病毒。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的遺傳進化不同，將HA分為H1-H17共17個亞型，NA分為N1-N10共10個亞型。H9N2禽流感病毒(AIV)是1966年首次在北美被分離到，該病毒經(jīng)過數(shù)十年的演變現(xiàn)在在全世界多個地區(qū)的家禽中流行，并且造成地方性流行

2、，一般發(fā)病比較溫和，有產(chǎn)蛋下降和呼吸道癥狀，但是如果繼發(fā)感染其他細菌和病毒可能會導致死亡率升高，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了不可估量的損失。而隨著H9N2的進化，其宿主范圍越來越廣，不僅能感染禽類，也能感染貓，豬，雪貂甚至人等多種哺乳動物，引起了H9N2對公共衛(wèi)生威脅的重視。同時H9N2為高致病性H5N1和H7N9提供內(nèi)部骨架，這兩種病毒都導致了人很高的死亡率，這個更引起了人們對H9N2流感的重視。
　　HA和NA是流感病毒最為重要的兩個表

3、面糖蛋白。HA負責與唾液酸受體結(jié)合，而NA負責把病毒從細胞表面解離出來達到釋放和傳播病毒的效果，兩者的活性及與唾液酸的相互作用是相互平衡的。H9和N2的結(jié)構(gòu)都已經(jīng)用X-ray晶體學技術(shù)解析出來，但是哪些氨基酸在抗原位點起關(guān)鍵作用并沒有很多報道。
　　本研究運用本實驗室分離的A/chicken/Jiangsu/x1/2004(H9N2)(X1)株H9N2病毒免疫小鼠，制備抗HA和NA單克隆抗體。通過研究這些單克隆抗體的生物學特性和其

4、與HA和NA結(jié)合的部位來確定在抗體產(chǎn)生過程中HA和NA蛋白哪些氨基酸是起關(guān)鍵作用。
　　1.抗H9N2病毒HA和NA單克隆抗體的研制
　　流感病毒RNA聚合酶缺少DNA聚合酶具有的校對功能，導致其復制過程中誤碼率很高，流感病毒在抗體作用下，病毒為逃避抗體壓易出現(xiàn)針對抗體的變異株，這也是流感很難控制的一個原因?；谶@一原理用單克隆抗體給其抗體壓，病毒很會產(chǎn)生針對抗體的變異，使其失去中和特性，通過比對可以確定抗體與蛋白的結(jié)合部位

5、。為確定盡可能多的蛋白抗原表位首先需要制備盡可能多的單克隆抗體。
　　本研究我們應(yīng)用X1株病毒按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與小鼠SP2/0骨髓瘤細胞融合，用感染X1株病毒的雞胚成纖維細胞(CEF)做間接免疫熒光試驗(IFA)檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清。結(jié)果:獲得16株分泌抗H9N2禽流感病毒單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1C3、1D1、1G8、2A1、2A8、2G4、2G11、3B10、4G3、5B4、5E10、5G

6、4、6A5、6A10、6B6和6E6。用血凝抑制(HI)試驗進一步篩選鑒定其抗HA的活性，結(jié)果獲得了8株抗H9N2 HA的單克隆抗體，分別是1C3、2G4、3B10、5B4、6A5、6A10、6B6和6E6。用H9N2HA基因構(gòu)建pcDNA-HA并轉(zhuǎn)染293T細胞，以篩選上述其他HI陰性的雜交瘤細胞上清，結(jié)果表明，單克隆抗體2A8能與pcDNA-HA轉(zhuǎn)染表達HA的細胞反應(yīng)，證明單克隆抗體2A8也為抗HA的抗體，但該抗體的HI為陰性。為檢

7、測剩余陽性雜交瘤是否有抗H9N2 NA單克隆抗體，我們用不同亞型禽流感病毒H1N1，H1N2，H9N1感染MDCK細胞進行IFA檢測分析，發(fā)現(xiàn)上述獲得的單克隆抗體1D1和1G8兩株均可以與H1N2反應(yīng)，顯示免疫熒光陽性，而不與其他病毒反應(yīng)，表明這兩株抗體為抗H9N2 NA的單克隆抗體。綜上所述，本研究通過雜交瘤技術(shù)共獲得抗H9N2HA的單克隆抗體9株，其中8株為HI陽性，1株HI陰性;獲得抗H9N2 NA的單克隆抗體2株。單克隆抗體的研

8、制為進一步研究抗原表位氨基酸分析提供了條件。
　　2.抗體壓力下H9N2病毒HA蛋白抗原位點氨基酸變異分析
　　HA是流感病毒最為重要的表面糖蛋白之一，負責與唾液酸受體結(jié)合。H9具有5個抗原區(qū)域，分別命名為抗原Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ。其中Ⅰ和Ⅱ抗原區(qū)域在三聚體的頭部，這部位產(chǎn)生的抗體表現(xiàn)出HI現(xiàn)象。
　　上述研究獲得單克隆抗體中有8株HI陽性的抗H9N2 HA的單克隆抗體，我們鑒定其亞類都為IgG，用8株抗體的腹水檢測HI

9、效價，發(fā)現(xiàn)其HI效價都很高，達到211-219。用細胞中和試驗證明，這些單克隆抗體具有很好的中和X1株H9N2病毒的能力，中和效價達到1∶5120-1∶655360。利用分離的所有H9N2病毒與這8株單克隆抗體進行HI試驗，發(fā)現(xiàn)1C3和2G4兩株單克隆抗體能與所有試驗的H9N2病毒產(chǎn)生很高HI效價，表明這兩株抗體可能針對H9N2上HA的保守部位。
　　利用篩選病毒的抗體逃逸株方法，本研究我們開展了在單克隆抗體壓力下的表位變化分析，

10、以期篩選獲得相應(yīng)的X1株病毒逃逸株。結(jié)果表明，不同單克隆抗體壓力下的H9N2存活能力不完全一致，其中病毒在1C3和2G4兩株抗體作用下生存能力較弱，經(jīng)過多次篩選才得到病毒逃逸株。通過精確篩選，共獲得9株H9N2病毒相應(yīng)單克隆抗體逃逸株（其中2G4單克隆抗體壓力下產(chǎn)生兩株逃逸株）。對單克隆抗體逃逸株HA測序分析，發(fā)現(xiàn)了10個氨基酸位點發(fā)生變異，變異位置分別在147、153、164、167、168、196、198、200、201和207位點

11、，其中164、167、168、196、198和207等6個位點是第一次報道。這10個位點都位于H9N2 HA的抗原位點Ⅰ和Ⅱ區(qū)域，新發(fā)現(xiàn)了6個位點位于H3的等同抗原區(qū)域B。利用NCBI公布的1563株H9N2病毒HA全序列分析發(fā)現(xiàn)，田間野生H9N2病毒的這10個位置都出現(xiàn)不同程度的變異，且這些變異與本研究獲得的結(jié)果相一致。該研究結(jié)果證明，抗體壓力下的H9N2HA抗原關(guān)鍵氨基酸位點發(fā)生變異是產(chǎn)生免疫逃逸的重要基礎(chǔ)，這些結(jié)果也為今后的疫苗研

12、制和H9N2監(jiān)測提供了科學依據(jù)。
　　3.抗體壓力下H9N2 NA抗原位點氨基酸變異分析
　　NA是流感病毒最重要的表面糖蛋白之一，其結(jié)構(gòu)為四聚體。NA負責把病毒從細胞表面解離出來達到釋放和傳染的作用。很多抗流感病毒的藥物都是針對NA蛋白設(shè)計的。
　　本研究以研究內(nèi)容一的兩株抗H9N2 NA的單克隆抗體為研究對象，通過Mu-NANA為底物檢測單克隆抗體對NA活性的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體1G8對H9N2 NA有很

13、好的抑制作用，效價達到25.4μg/mL;而單克隆抗體1D1沒有呈現(xiàn)相同的作用。為了進一步驗證單克隆抗體1D1在NA中的作用，本研究用酶聯(lián)凝集素試驗(ELLA)對其NA活性的抑制作用進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩株抗體都能抑制NA的活性，抑制活性效價分別為1.8μg/mL和0.4μg/mL。這些結(jié)果提示，單克隆抗體1G8能很好地抑制NA活性，針對的位點可能位于NA活性中心附近;而單克隆抗體1D1結(jié)合部位距NA活性中心可能較遠，不能完全阻止Mu

14、-NANA和NA結(jié)合。
　　利用抗H9N2 NA特異性單克隆抗體處理X1株病毒，篩選在抗體免疫壓力下的H9N2NA變異逃逸株。結(jié)果成功篩選獲得單克隆抗體1D1壓力下的逃逸株，命名為m1D1;單克隆抗體1G8壓力下獲得兩株逃逸株分別命名為m1G8-1和m1G8-2。將這些逃逸株NA測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，m1D1出現(xiàn)R338S變異，m1G8-1和m1G8-2分別出現(xiàn)D198N，K199E變異。利用NCBI公布的1130株H9N2的NA全

15、序列分析，發(fā)現(xiàn)在這三個位置的氨基酸并不保守，都出現(xiàn)了不同程度的變異，其中198和199位置出現(xiàn)了和逃逸株相同的氨基酸變異。這些結(jié)果證明，抗體壓力下的NA變異，是禽流感逃逸的主要方式之一;這些結(jié)果也為禽流感的進化和檢測提供了科學依據(jù)。
　　4.單克隆抗體2A8與H9N2 HA結(jié)合位點的鑒定
　　HA是流感病毒最為重要的表面糖蛋白之一，具有典型的三聚體結(jié)構(gòu)，大部分針對其頭部的抗體都具有HI效價，但是有些針對莖部抗原區(qū)域的抗體不具

16、備HI功能，但能有效中和病毒感染;這類抗體一般具有較廣的反應(yīng)譜。
　　本研究我們運用實驗內(nèi)容一制備的HI陰性的抗H9N2 HA單克隆抗體2A8進行中和試驗，發(fā)現(xiàn)其能很好的中和X1株病毒，中和效價為12.5μg/mL，同時IFA中2A8能很好的與H1N1和H1N2結(jié)合，證明這株抗體為廣譜性單克隆抗體。應(yīng)用低濃度的單克隆抗體2A8與H9N2作用，然后篩選相應(yīng)的逃逸株。結(jié)果獲得4株H9N2單克隆抗體2A8的免疫逃逸株，序列分析發(fā)現(xiàn)，免疫