新型PA-X蛋白及PB2-627位氨基酸對(duì)豬流感病毒復(fù)制和致病能力的影響.pdf

1、PA-X是由Jagger等人在2012年發(fā)現(xiàn)的一種由于PA基因發(fā)生+1核糖體移碼產(chǎn)生的一種新型蛋白。目前關(guān)于PA-X的功能研究主要圍繞1918年西班牙H1N1人流感病毒、2009年甲型H1N1人流感病毒、高致病性H5N1及H9N2禽流感病毒進(jìn)行。然而，PA-X對(duì)于豬流感病毒復(fù)制和致病能力的影響仍舊沒有得到證明。為了探究 PA-X蛋白對(duì)豬流感病毒復(fù)制和致病能力的影響，我們?cè)诠诺銱1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳操作平臺(tái)基礎(chǔ)上，通過點(diǎn)突變構(gòu)建

2、了PA-X缺失的重組質(zhì)粒，拯救了野生株和PA-X缺失株。通過比較野生株和PA-X缺失株在體外細(xì)胞系和小鼠體內(nèi)的復(fù)制和致病能力來解析PA-X對(duì)豬流感病毒生物學(xué)特性的影響。此外，我們還比較了野生株和PA-X缺失株聚合酶活性的差異。研究結(jié)果表明：PA-X缺失明顯增強(qiáng)了古典 H1N1亞型豬流感病毒在 MDCK和A549細(xì)胞上的復(fù)制水平，在PK-15細(xì)胞上兩者的復(fù)制能力雖然沒有明顯的差異，但缺失株也略高于野生株；PA-X缺失導(dǎo)致病毒在小鼠肺臟的復(fù)

3、制能力得到提高，肺臟的病變更加嚴(yán)重，表現(xiàn)為體重下降幅度增大，致死率提高；PA-X缺失后豬流感病毒的聚合酶活性提高。
　　大多數(shù)情況下PA-X的C末端由X-ORF編碼的61個(gè)氨基酸構(gòu)成，但在某些情況下，X-ORF會(huì)由于在第42個(gè)密碼子處TGG(Trp）突變?yōu)門AG（終止密碼子）而編碼只有41個(gè)氨基酸的短肽。本研究中野生毒株表達(dá)的X部分只有41個(gè)氨基酸，為了探究C端20個(gè)氨基酸對(duì)古典H1N1亞型豬流感病毒復(fù)制和致病能力的影響，我們將野

4、生毒株的PTC進(jìn)行突變，構(gòu)建表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的重組質(zhì)粒，拯救PA-X恢復(fù)全長(zhǎng)的突變毒株，然后通過體內(nèi)外試驗(yàn)探究20個(gè)氨基酸對(duì)病毒的影響。研究結(jié)果表明：PA-X恢復(fù)全長(zhǎng)后，病毒在MDCK、A549細(xì)胞上的復(fù)制能力得到明顯提高，在PK-15細(xì)胞上PA-X恢復(fù)全長(zhǎng)株的復(fù)制能力也稍微高于野生株；PA-X恢復(fù)全長(zhǎng)后，小鼠的體重下降增多，死亡率提高，肺臟病變加重，病毒在肺臟中的復(fù)制速度加快，表明C端20個(gè)氨基酸對(duì)病毒的復(fù)制和致病能力起著非常重要的作

5、用；PA-X恢復(fù)全長(zhǎng)導(dǎo)致病毒的聚合酶活性提高。
　　PB2-627K是決定流感病毒宿主適應(yīng)性的一個(gè)重要因素，研究表明PB2-627K能夠提高禽流感病毒、人流感病毒、古典 H1N1亞型豬流感病毒和三源重組豬流感病毒在小鼠模型上的致病力。豬流感病毒PB2基因的遺傳演化分析結(jié)果表明，人源H3N2亞型豬流感病毒PB2基因與古典H1N1和三源重組毒株的遺傳差異均很大，而且關(guān)于PB2-627這一位點(diǎn)對(duì)于人源H3N2亞型豬流感病毒復(fù)制和致病能力

6、的影響，目前國(guó)內(nèi)外還沒有相關(guān)研究。本研究中，我們首先成功構(gòu)建了人源H3N2亞型豬流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過點(diǎn)突變技術(shù)將重組質(zhì)粒的PB2-627位由K突變?yōu)镋，進(jìn)而進(jìn)行野生株和突變株的拯救，然后通過細(xì)胞和小鼠上的試驗(yàn)比較突變前后病毒的復(fù)制和致病能力的變化，研究結(jié)果證明：PB2-627位由K突變?yōu)镋后，病毒在MDCK、A549、PK-15細(xì)胞上的復(fù)制能力明顯下降；在 MDCK細(xì)胞上形成的空斑形態(tài)和大小比較結(jié)果也證明627K野生株比62