豬流感病毒的分離鑒定和豬流感血清流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、豬流感(Swine Influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine Influellza vires，SIV)引起豬的一種急性、高度接觸性的呼吸道傳染病。1918年美國(guó)首次報(bào)道了SI的爆發(fā)，而直到二十世紀(jì)二十年代末才從豬體中分離到第一株SIV。 本研究對(duì)中國(guó)河南、湖北、湖南、廣東、福建、安徽等省市32份死亡豬肺樣品進(jìn)行病毒分離，陽(yáng)性培養(yǎng)物與2004年分離毒株進(jìn)行純化和生物學(xué)特性研究。在此基礎(chǔ)上，對(duì)8株SIV分離株的全基因組

2、(包括NS、M、NA、NP、HA、PA、PB1、PB2基因)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆和核苷酸序列測(cè)定，對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比較和分析，用MEAG(3.1)分析軟件構(gòu)建全基因組核苷酸遺傳進(jìn)化樹，并對(duì)其分子流行病學(xué)及遺傳演化進(jìn)行分析。以SWTJ/01/04為模板表達(dá)HA蛋白，利用純化蛋白建立檢測(cè)H1亞型SIV抗體的間接ELISA方法并進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查。具體結(jié)果如下： 1．SI的病原學(xué)研究：2006年從32份死亡豬肺樣品中分離到1株

3、H1N1亞型SW，1株H3N8亞型SW和2株H5N1亞型SW。 2．SIV分離株的有限稀釋克隆純化：8株SIV進(jìn)行有限稀釋克隆并獲得稀釋克隆毒株，其HA價(jià)在1：256～1：1024之間。 3．SIV分離株生物學(xué)特性的比較：MDT試驗(yàn)結(jié)果表明，8株SIV分離株中SWTJ/01/04、SWTS/01/04和SWHB/05/06對(duì)禽表現(xiàn)為中等致病力，其他5株對(duì)禽表現(xiàn)為低致病力。SIV分離株的EDso差別不大，其中SWTS/01

4、/04分離株最高，為10<'-9.0>/0.2mL，其他分離株在10<'-7.0>～10<'-8.5>/0.2mL之間。不同毒株之間TCD<,50>差異顯著，除SWTJ/01/04分離株不具備感染MDCK細(xì)胞的能力外，其他分離株在10<'-2.0>～10<'-8.5>/mL之間。MLD<,50>測(cè)定結(jié)果表明，SWTJ/01/04、SWHN/01/06、SWCB/01/04、SWAH/01/06和SWSX/01/04不致死小鼠，其他分離株

5、的MLD<,50>在1<'-4.0>～10<'-6.0>/0.1mL之間。 4．血凝素?zé)岱€(wěn)定性和血凝素凝集譜分析：不同地區(qū)SIV分離株的血凝素?zé)岱€(wěn)定性差異較大，其中SWTJ/01/04、SWHN/01/06、SWCB/01/04、SWAH/01/06分離株表現(xiàn)為熱穩(wěn)定型，其他4株表現(xiàn)為熱不穩(wěn)定型。所有SIV分離株均能凝集雞、豚鼠和綿羊的紅細(xì)胞，其他差異表現(xiàn)在對(duì)豬、兔、小鼠、牛紅細(xì)胞的凝集特性上。 5．SIV分離株全基因組

6、的RT-PCR擴(kuò)增、克隆和核苷酸序列測(cè)定：根據(jù)E．Hoffman等關(guān)于A型流感病毒全長(zhǎng)基因擴(kuò)增通用引物的描述分別設(shè)計(jì)了一條反轉(zhuǎn)錄通用引物和8對(duì)特異性引物，以病毒RaNA為模板，RT-PCR成功擴(kuò)增了SIV NS、M、NA、NP、HA、PA、PB1和PB2基因cDNA片斷，將其純化、克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，獲得不同基因的核苷酸序列。 6．SIV分離株全基因組核苷酸遺傳進(jìn)化分析：從HA核苷酸水平看，HA形成3個(gè)明顯的部分，H1N1亞型分

7、離株HA基因?qū)儆谌肆鞲胁《痉种?，該枝系所有毒株的HA基因起源于A/Brevig.Mission/1/1918(H1N1)，并與A/Yaiwan/01/86(H1N1)同源性最高。H3亞型SIV分離株屬于馬流感病毒分枝。H5亞型SIV分離株的HA基因與A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)同源性最高。從NA核苷酸序列進(jìn)化樹看，SWTJ/01/04和SWHN/01/06與A/Taiwan/01/86(H1N1)毒株同源

8、性最高，H5亞型SIV分離株的NA基因均由A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)提供。本研究中首次從豬體內(nèi)分離到H3N8亞型流感病毒，除NS和PB2基因外，其他基因均由馬流感病毒提供。SWAH/01/06分離株的NS基因由A/Taiwan/01/86(H1N1)提供，PB2基因與SWSX/01/04親緣關(guān)系最近。SWCB/01/04為其他同亞型毒株提供NA基因。 7.H1亞型SIV間接ELISA方法建立：利

9、用純化的HA蛋白作為包被抗原建立檢測(cè)H1亞型SIV抗體的間接ELISA方法。確立蛋白包被濃度為0.066 ug/孔，血清以1：40稀釋。與HI試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，敏感性、特異性和符合率分別為90.9％、80.9％和85.0％。 8.間接ELISA方法在血清流行病學(xué)中的應(yīng)用：從華中地區(qū)(包括湖北、湖南、安徽、江西、河南、山西等省市)收集2006年5～月臨床豬血清2,029份。用間接ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，平均陽(yáng)性率為23.46％。其中6

10、、7和12月平均陽(yáng)性率均超過平均值，分別為25.35％、24.92％和51.42％。華中地區(qū)以湖北、湖南和河南3省檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率較高，分別為24.04％、24.24％、22.96％。 總之，本研究對(duì)華中地區(qū)的血清學(xué)和病原學(xué)開展SI流行病學(xué)調(diào)查研究，證實(shí)中國(guó)豬群中存在H1、H3和H5亞型SIv的感染。通過SIV分離株全基因組全長(zhǎng)核苷酸序列的比較，從分子水平闡明其親緣關(guān)系及遺傳進(jìn)化趨勢(shì)，確定SIV分離株在流感病毒系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化中的地