豬圓環(huán)病毒2型糖基化位點突變對病毒復(fù)制能力和致病性的影響及抗體膠體金檢測方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬呼吸道病復(fù)合征（PRDC）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬增生性和壞死性肺炎（PNP）、豬的流產(chǎn)和死亡綜合征（SAMS）和豬先天性腦震顫（CT）等嚴(yán)重危害我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的疫病的主要原因，感染后能引起感染母豬繁殖障礙以及免疫抑制，造成極大的經(jīng)濟損失。
　　世界各地分離的PCV2毒株被分成不同的亞型而且毒株

2、也在不斷發(fā)生變異。從2005年到2013年課題組共從山東省分離到32株P(guān)CV2毒株。對這32株病毒全基因組進(jìn)行了測序并遞交GenBank。同源性分析發(fā)現(xiàn)32株P(guān)CV2 ORF1基因編碼蛋白質(zhì)同源性為98.4-100％，而且三個糖基化位點23-25aa（NPS）、256-258aa（NQT）及286-288aa（NAT）沒有發(fā)生變異。ORF2基因編碼蛋白質(zhì)同源性為88-100%，其糖基化位點143-145aa（NYS）同樣沒有發(fā)生變異。遺

3、傳演化分析顯示PCV2b/1C亞型是目前山東省主要流行亞型，可能是由于選擇的壓力，此亞型已與目前使用的PCV2疫苗亞型明顯不同。
　　感染性克隆是研究病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能以及病毒宿主相互作用的重要手段，是純化病毒以進(jìn)行致病性研究和疫苗生產(chǎn)最好的方法。為了獲得PCV2的感染性克隆，本研究通過對構(gòu)建PCV2的感染性克隆方法進(jìn)行比較獲得了較好的拯救病毒的方法。本研究共構(gòu)建四種PCV2感染性克隆并轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞。應(yīng)用IFA和Real-

4、time PCR方法檢測拯救病毒。結(jié)果顯示四種方法構(gòu)建的感染性克隆都能夠用IFA檢測到拯救病毒。但是Real-time PCR結(jié)果顯示環(huán)化DNA轉(zhuǎn)染的方法能夠檢測到最多的PCV2 DNA拷貝，pEASY-PCV2方法拷貝數(shù)最少，pSK-2PCV2和pSK-PCV2兩種方法檢測到相似的DNA拷貝數(shù)。本研究為PCV2感染性克隆的構(gòu)建和拯救打下了良好的基礎(chǔ)。
　　為研究PCV2 Cap蛋白糖基化位點對病毒復(fù)制以及致病性的影響，以實驗室前

5、期構(gòu)建的含有PCV2全基因組的重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-PCV2為最初模板。利用重疊PCR和感染性克隆構(gòu)建方法，設(shè)計1對引物，對PCV2 Cap蛋白上N-糖基化位點143aa-145aa（NYS）進(jìn)行突變（將N突變?yōu)镈），構(gòu)建含突變位點感染性克隆并成功拯救病毒。結(jié)果顯示糖基化位點突變對病毒的復(fù)制能力與未突變病毒差異不顯著（P>0.05）。對拯救病毒傳代后，人工感染6周齡BALB/c雌性小鼠。結(jié)果顯示含有突變位點拯救病毒攻毒后影響攻

6、毒小鼠的體重增長，并能在血液中檢測到PCV2特異性抗體，在攻毒小鼠各個臟器中都能檢測到病毒，病理檢測結(jié)果顯示PCV2對各個臟器都造成不同程度的損傷，并且在抗體水平、損傷程度等方面與不含突變位點感染性克隆攻毒組差異不顯著（P>0.05），但與細(xì)胞液攻毒對照組相比差異極顯著（P<0.01）。
　　PCV2引起的系列疾病頻繁爆發(fā)給各地養(yǎng)豬業(yè)疫病防控帶來巨大的難題。為了實現(xiàn)對PCV2的快速診斷，課題組采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，并

7、將其標(biāo)記SPA，將金標(biāo)SPA包被至玻璃纖維膜上制備金標(biāo)墊，將純化的Cap蛋白、抗SPA抗體分別包被至硝酸纖維素膜的檢測線與質(zhì)控線上，建立了一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的膠體金免疫層析方法，并組裝試紙條。檢測結(jié)果顯示，組裝的檢測卡只與豬圓環(huán)病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，檢測的靈敏度可以稀釋到100倍。用此檢測卡與商品化ELISA試劑盒對86份臨床血清進(jìn)行對比檢測，兩者的陽性率分別為65.12%和70.93%，符合率為94.2%。該方法檢測速度