甲型H1N1流感病毒HA上糖基化位點(diǎn)及H1N2豬流感病毒致病性研究.pdf

1、分析2009年大流行H1N1流感病毒(H1N1/2009)和季節(jié)性H1N1流感病毒的HA基因片段發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的人季節(jié)性H1N1流感毒株HA上142和177位點(diǎn)都有糖基化，而在H1N1/2009流感毒株中這兩個(gè)位點(diǎn)都沒(méi)有糖基化。為了探究H1N1/2009流感病毒引入這兩個(gè)糖基化位點(diǎn)后對(duì)小鼠毒力和致病性的影響，本研究使A/Mexico/4486/2009(H1N1)這株病毒獲得這兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，研究突變毒株的抗原性變化和致病性的差異，以期

2、發(fā)現(xiàn)糖基化對(duì)病毒致病機(jī)制的調(diào)控。
　　 目前在世界范圍內(nèi)流行的豬流感主要包括三種亞型:H1N1、H3N2、H1N2，包括古典H1N1豬流感，類(lèi)禽H1N1豬流感，類(lèi)人H3N2豬流感，重組H3N2和其他多種重組型的H1N2豬流感。中國(guó)報(bào)道的20株H1N2豬流感病毒目前仍沒(méi)有詳細(xì)的基因型和重組特征分析，為此根據(jù)流感病毒庫(kù)中的序列對(duì)比，本文將H1N2豬流感病毒進(jìn)行具體分型，并且利用2009年本實(shí)驗(yàn)室在湖北某豬場(chǎng)分離到的兩株H1N2豬流感

3、病毒進(jìn)行小鼠致病性研究，為H1N2豬流感的防控奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1甲型H1N1流感病毒糖基化位點(diǎn)的改變對(duì)其毒力和致病性的研究
　　 利用定點(diǎn)突變和反向遺傳操作技術(shù)使A/Mexico/4486/2009(H1N1)病毒獲得142和177這兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，構(gòu)建三個(gè)突變毒株H1N1/144、H1N1/177和H1N1/144+177，分別具有142、177和142+177糖基化位點(diǎn)。與野生型H1N1/2009

4、毒株(H1N1/WT)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn):(1)糖基化位點(diǎn)的引入使得病毒HA抗原特異性及其對(duì)受體的親和能力發(fā)生改變，單抗對(duì)具有142糖基化位點(diǎn)的突變毒株中和能力下降，且糖基化位點(diǎn)突變毒株從紅細(xì)胞上洗脫時(shí)間延長(zhǎng)。(2)體外生物學(xué)特性研究顯示，H1N1/144突變株在雞胚上增殖能力最強(qiáng)，H1N1/144+177次之，H1N1/177和H1N1/WT差異不顯著。H1N1/144+177的毒力最強(qiáng)，三個(gè)突變毒株毒力都要強(qiáng)于野生型毒株。(3)對(duì)小鼠的致

5、病性方面，H1N1/144在小鼠肺臟病毒滴度最高，H1N1/144+177其次，H1N1/177與H1N1/WT差異不顯著。三個(gè)糖基化毒株對(duì)小鼠毒力比野生型毒株強(qiáng)，但這四個(gè)毒株都不致死小鼠。引入糖基化位點(diǎn)毒株可引起小鼠肺臟多種炎性因子早期顯著上調(diào)表達(dá)，與H1N1/WT相比，H1N1/177和H1N1/144+177可誘導(dǎo)IL-1β顯著上調(diào)，H1N1/144+177可誘導(dǎo)MCP-1、TNF-α、IFN-γ顯著上調(diào)，H1N1/144和H1N

6、1/177誘導(dǎo)IL-10顯著上調(diào)。突變毒株感染小鼠后肺臟出現(xiàn)典型的流感病毒感染損傷，包括毛細(xì)支氣管炎、上皮細(xì)胞脫落壞死和肺泡炎，其中突變毒株引起的肺臟損傷比野生型嚴(yán)重，尤以H1N1/144+177導(dǎo)致的肺臟損傷最為嚴(yán)重。
　　 2 H1N2豬流感病毒基因型分析及其對(duì)小鼠的致病性和炎性反應(yīng)
　　 (1)本研究對(duì)A/swine/Hubei/04/2009(HB/04)和A/swine/Hubei/05/2009(HB/05)

7、這兩株病毒以及2004-2010年在中國(guó)報(bào)道的其他18株H1N2豬流感病毒進(jìn)行基因型分析發(fā)現(xiàn)，這20株H1N2豬流感病毒可分為6種不同的基因型:2個(gè)重組型來(lái)源于三源重組H3N2和古典H1N1豬流感病毒，3個(gè)重組型來(lái)源于三源重組H1N2、歐亞類(lèi)禽H1N1和H9N2豬流感病毒，1個(gè)重組型來(lái)源于人H1N1、人H3N2和古典H1N1流感病毒。三源重組H1N2豬流感病毒是主要的基因型，本實(shí)驗(yàn)室分離到的也屬于此類(lèi)型。(2)體外生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，H

8、B/04和HB/05的EID50分別為10-6.4/200μL和10-5.2/200μL。HB/04和HB/05都可達(dá)到較高血凝價(jià)，HB/05的血凝價(jià)為211，比HB/04的29高。HB/04和HB/05的雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)分別為76.8 h和72 h。TCID50都為10-7.6/100μL。(3)利用小鼠作為動(dòng)物模型研究這兩株病毒的致病性發(fā)現(xiàn)，病毒可在小鼠肺臟有效增殖，第5天可從直腸檢測(cè)到排毒。HB/04和HB/05感染小鼠