MicroRNA介導(dǎo)甲型H1N1流感病毒減毒株的致病力及免疫效力研究.pdf

1、目的:
　　本研究的目的就是通過(guò)鼻腔免疫BALB/c小鼠的方法驗(yàn)證miRT-H1N1是否在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)減毒，初步評(píng)估其安全性。然后從體液免疫、細(xì)胞免疫、粘膜免疫三個(gè)方面研究miRT-H1N1的免疫原性，并評(píng)價(jià)miRT-H1N1對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性。為microRNA介導(dǎo)的流感病毒減毒活疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.miRT-H1N1的致病力研究
　　應(yīng)用血凝試驗(yàn)測(cè)定三種病毒miRT-H1N1、scbl-

2、H1N1和wt-H1N1的血凝素(HA）效價(jià)，并用組織細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)這三種病毒在雞胚中的半數(shù)組織細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)。選用6周齡BALB/c雌性小鼠為動(dòng)物模型，按病毒種類(miRT-H1N1、scbl-H1N1和wt-H1N1)及不同梯度劑量分組，每組10只，PBS對(duì)照組每組5只。將各個(gè)稀釋度(107TCID50～103TCID50)病毒液滴鼻感染小鼠，連續(xù)觀察14天，記錄體重變化和死亡情況，Reed-Muench法計(jì)算小鼠

3、MLD50。將12只6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為3組(miRT-H1N1組、scbl-H1N1、wt-H1N1)，每組4只，經(jīng)鼻滴入105TCID50病毒液，分別于感染后第3、5天取肺組織，檢測(cè)病毒載量。感染第3天，取小鼠肺組織，抽提其病毒RNA，用RT-PCR法擴(kuò)增miRT-H1N1和WT-H1N1的PB1基因片段，送檢測(cè)序。
　　2.miRT-H1N1的免疫原性研究
　　將6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為miRT

4、-H1N1組和PBS對(duì)照組，每組6只，第1次免疫后28天加強(qiáng)免疫1次。采集第一次免疫后28天，第二次免疫后14天小鼠血清，應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)(HI)、病毒中和試驗(yàn)(MN)和免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA)，分別測(cè)定血凝抑制抗體、血清病毒中和抗體和血清抗體IgG。采集第2次免疫后14天鼻腔、肺臟沖洗液，經(jīng)ELISA測(cè)定分泌性抗體(sIgA)。采集第2次免疫后14天小鼠脾細(xì)胞懸液，經(jīng)ELISA測(cè)定IFN-γ和IL-4水平。
　　3.miR

5、T-H1N1的免疫保護(hù)性研究
　　將6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為miRT-H1N1組和PBS對(duì)照組，每組12只，免疫方法同前。在第二次免疫后14天通過(guò)滴鼻方式給予100LD50的H1N1流感病毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。其中6只觀察小鼠14天內(nèi)體重變化及存活率，另外6只小鼠于攻毒第3，5天處死，采集小鼠肺組織病理切片HE染色觀察病理變化，參照Cimolai等的病理評(píng)分系統(tǒng)行肺組織病理評(píng)分HPS(Histopathologic Score

6、)。并用組織細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)肺組織病毒載量。RT-PCR法檢測(cè)攻毒第3、5天小鼠肺組織炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。
　　結(jié)果:
　　1.miRT-H1N1的致病力研究
　　(1)體外實(shí)驗(yàn)中，三種病毒miRT-H1N1、scbl-H1N1及WT-H1N1的血凝素(HA)效價(jià)分別為1∶29、1∶28、1∶28。雞胚中培養(yǎng)的miRT-H1N1病毒滴度與WT-H1N1、scbl-H1N1的相似，三組間差異無(wú)

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)小鼠體重變化及半數(shù)致死量:成功構(gòu)建了2009甲型H1N1流感病毒株(A/Nanjing/108/2009 H1N1)感染BALB/c小鼠模型。實(shí)驗(yàn)觀察到WT-H1N1組小鼠自感染病毒第3天開(kāi)始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，食欲減退，體重下降等癥狀，第5至8天小鼠體重陸續(xù)下降超過(guò)原始體重的25％，實(shí)施安樂(lè)死，其中107TCID50劑量組全部死亡。與之相反，感染miRT-H1N1的小鼠活動(dòng)基本正常，即使感染最高劑量(107TC

8、ID50)的miRT-H1N1，小鼠體重下降也不明顯(＜10％)，沒(méi)有出現(xiàn)死亡，即LD50＞107TCID50。WT-H1N1與scbl-H1N1組的半數(shù)致死量相似，分別為105.3TCID50,105.38 TCID50。
　　(3)小鼠肺組織病毒載量:在感染第3、5天小鼠的肺組織內(nèi)均可分離出病毒，感染第3天wt-H1N1組的病毒滴度與scbl-H1N1組相似，分別為105.37TCID50/g，105.49 TCID50/g，

9、而miRT-H1N1組的病毒滴度為103.50 TCID50/g，明顯低于野毒株(P＜0.05)。感染第5天，三組病毒滴度有所下降，分別為103.71、103.49、101.5 TCID50/g，與wt-H1N1組、scbl-H1N1組相比，miRT-H1N1組的病毒滴度明顯降低，下降超過(guò)100倍(P＜0.05)。用RT-PCR法擴(kuò)增小鼠肺組織中miRT-H1N1和WT-H1N1的PB1基因片段，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增到了特異性的目的條帶，測(cè)

10、序確認(rèn)重組突變病毒miRT-H1N1包含突變目標(biāo)序列，未發(fā)現(xiàn)有病毒逃逸突變體。
　　2.miRT-H1N1的免疫原性研究
　　(1)miRT-H1N1免疫后小鼠體液免疫應(yīng)答效果: miRT-H1N1滴鼻免疫BALB/c小鼠28天后即可刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生較高水平的血lgG、HI和病毒中和抗體，抗體幾何平均滴度分別為905、403、227，二免14天小鼠體內(nèi)血清抗體滴度達(dá)到最高，分別為2873、2032、313，與PBS對(duì)照組比較

11、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第2次免疫后小鼠血清lgG、HI水平較第1次免疫后明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)miRT-H1N1免疫后小鼠粘膜免疫應(yīng)答效果:miRT-H1N1免疫的小鼠鼻沖洗液和肺沖洗液均可檢測(cè)到sIgA，抗體幾何平均滴度分別為16、64，而PBS對(duì)照組的sIgA＜10，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)miRT-H1N1免疫后小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答效果:予以miRT

12、-H1N12次免疫小鼠后，特異性HA抗原與免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清測(cè)定IFN-γ、IL-4結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組小鼠IFN-γ、IL-4兩種細(xì)胞因子的濃度很低，分別為17.4pg/ml、24.1 pg/ml，而miRT-H1N1組用HA刺激后， IFN-γ、IL-4分別達(dá)到了54.5pg/ml、70.9pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示miRT-H1N1在小鼠體內(nèi)能夠同時(shí)誘導(dǎo)Th1和Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　3

13、.miRT-H1N1的攻毒保護(hù)性研究
　　(1)攻毒實(shí)驗(yàn)中小鼠體重變化及生存率:同源流感病毒wt-H1N1攻毒后第2天開(kāi)始，用PBS免疫的小鼠即開(kāi)始出現(xiàn)食欲減退，活動(dòng)減少等癥狀，體重下降明顯，最低下降到原體重的72.5％，下降程度超過(guò)原始體重的25％，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，至攻毒第8天，小鼠全部死亡，存活率為0。與之相反，用miRT-H1N1免疫的小鼠活動(dòng)基本正常，體重輕度下降，攻毒第8天后體重恢復(fù)至初始體重，存活率達(dá)到了100％。<

14、br>　　(2)攻毒后小鼠肺組織病毒載量、病理及炎癥因子變化:攻毒第3天，miRT-H1N1組小鼠肺組織病毒滴度為101.53 TCID50/g，明顯低于PBS對(duì)照組的105.13 TCID50/g(P＜0.05)。攻毒第5天，PBS對(duì)照組小鼠肺組織病毒滴度下降至103.8 TCID50/g，而miRT-H1N1組小鼠肺組織中未分離出病毒。攻毒第5天，PBS組小鼠肺組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理改變，包括肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，壞死性支氣管炎，組織廣泛出血

15、等，相比之下，miRT-H1N1組小鼠肺組織只有輕微的組織病理變化。與之一致的是PBS對(duì)照組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分高達(dá)20.3，而miRT-H1N1組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分僅為7.3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。攻毒第3天miRT-H1N1組小鼠肺組織炎癥因子IL-6，TNF-α，IFN-β的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(2.6±0.8，2.4±0.4，10.6±4.7)，低于PBS對(duì)照組(10.7±1.6，4.4±1.1，39.7±15

16、.5)(P＜0.05)。攻毒第5天小鼠體內(nèi)相關(guān)炎癥反應(yīng)有所減弱， miRT-H1N1組小鼠肺組織IL-6，TNF-α，IFN-β的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.5±0.3，1.3±0.1，2.3±0.6)，低于PBS對(duì)照組(4.0±1.2，3.0±0.9，2.3±0.6)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.miRT-H1N1在BALB/c小鼠肺組織中的毒性較WT-H1N1、scbl-H1N1顯著減弱，其致病力較野毒株明顯