甲型H1N1流感假病毒模型的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、目的：本課題針對流感病毒感染宿主機(jī)體的作用機(jī)制，利用分子生物技術(shù)、細(xì)胞生物技術(shù)構(gòu)建用于抗流感病毒類藥物篩選和評價(jià)的甲型H1N1流感假病毒模型，并對其應(yīng)用進(jìn)行探索。利用構(gòu)建的流感假病毒模型系統(tǒng)評價(jià)流感免疫血清的中和效價(jià)、評價(jià)帕拉米韋氯化鈉注射液和板藍(lán)根藥材提取液的抗流感病毒活性，從而為該類藥物的研發(fā)建立了安全、有效的抗流感病毒檢測方法。
　　方法：
　　方法一：甲型H1N1流感假病毒模型的構(gòu)建
　　1、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2、：選擇H1N1流感病毒亞型A/California/04/2009為模板，合成相應(yīng)的血球凝集素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)全長cDNA序列，通過酶切和連接反應(yīng)與pcDNA3.1+載體合成重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行重組表達(dá)質(zhì)粒的擴(kuò)增，采用測序、酶切及PCR等方法鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2、甲型H1N1流感假病毒制備：將pNL4-3.Luc.R-E-（簡稱pNL，下同）

3、與重組表達(dá)質(zhì)粒（HA與NA）或VSV-G（Vesicular Stomatitis Virus G，水皰性口炎病毒G蛋白）質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞，取細(xì)胞上清，過濾后即得甲型H1N1流感假病毒和 VSV-G假病毒。將獲得的流感假病毒感染宿主細(xì)胞，檢測宿主細(xì)胞內(nèi)的熒光值。
　　1）包裝細(xì)胞的篩選:將pNL與HA、NA或VSV-G分別轉(zhuǎn)染pheonix293細(xì)胞、293FT細(xì)胞和293T細(xì)胞后，通過檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度篩選適用于本研究

4、實(shí)驗(yàn)體系的包裝細(xì)胞。
　　2）宿主細(xì)胞的篩選:將獲得的流感假病毒感染MDCK細(xì)胞、A549細(xì)胞、293T細(xì)胞和HEK293細(xì)胞，通過檢測被感染細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度篩選適用于本研究實(shí)驗(yàn)體系的宿主細(xì)胞。
　　3、流感假病毒模型驗(yàn)證：將獲得流感假病毒感染 HEK293宿主細(xì)胞，通過檢測宿主細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度評價(jià)流感假病毒的感染活性。用WHO推薦抗流感病毒藥奧司他韋及奧司他韋酸作為陽性藥物，評價(jià)所構(gòu)建的流感假病毒模型，證明流感假病毒模型構(gòu)建成

5、功。
　　方法二：甲型H1N1流感假病毒模型的應(yīng)用
　　1、流感免疫血清中和效價(jià)評價(jià)：將流感假病毒與不同稀釋比例流感病毒免疫血清（Influenza Anti-A/California/7/2009 HA Serum Sheep535，536，537，538）作用后，感染HEK293宿主細(xì)胞，通過檢測宿主細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度評價(jià)免疫血清的中和效價(jià)。
　　2、化學(xué)藥物帕拉米韋抗病毒活性評價(jià)：依據(jù)帕拉米韋抗流感病毒作用機(jī)制，在假

6、病毒生成階段加入帕拉米韋，獲得假病毒后，感染HEK293宿主細(xì)胞，通過檢測宿主細(xì)胞熒光強(qiáng)度評價(jià)帕拉米韋對流感假病毒的抑制作用。
　　3、中藥板藍(lán)根抗病毒活性評價(jià)：將流感假病毒與板藍(lán)根藥材提取液作用后，感染HEK293宿主細(xì)胞，通過檢測宿主細(xì)胞熒光強(qiáng)度評價(jià)板藍(lán)根藥材提取液對假病毒的抑制作用。另外，通過經(jīng)典雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)和NA酶活檢測實(shí)驗(yàn)評價(jià)板藍(lán)根藥材提取液的抗流感病毒活性，與假病毒方法比較，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法在中藥抗流感病毒藥效中的作

7、用。
　　結(jié)果：
　　結(jié)果一：甲型H1N1流感假病毒模型的構(gòu)建
　　1、轉(zhuǎn)化后提取的重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切與PCR產(chǎn)物電泳條帶在同一位置，目的條帶的大小與預(yù)期條帶大小一致，測序結(jié)果也與GenBank目的基因一致，證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2、3株包裝細(xì)胞（293T細(xì)胞、pheonix293細(xì)胞和293FT細(xì)胞）的胞內(nèi)熒光值檢測結(jié)果顯示，293T包裝細(xì)胞內(nèi)的相對熒光素酶活性（Relative Luciferase

8、 Activity， RLA）值比pheonix293細(xì)胞和293FT細(xì)胞的RLA值高，包裝效率最高，確定293T細(xì)胞作為本研究實(shí)驗(yàn)體系的包裝細(xì)胞。4株宿主細(xì)胞（293T細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、A549細(xì)胞及HEK293細(xì)胞）的胞內(nèi)熒光值檢測結(jié)果顯示，HEK293細(xì)胞的RLA值比293T細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和A549細(xì)胞的RLA值高，易感性最好，確定HEK293細(xì)胞作為本研究實(shí)驗(yàn)體系的宿主細(xì)胞。同時，感染結(jié)果表明制備的假病毒具有感染流感易感細(xì)

9、胞的能力（實(shí)驗(yàn)組RLA值和陰性對照組RLA值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異）。
　　3、陽性藥物評價(jià)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示奧司他韋和奧司他韋酸對制備的流感假病毒的抑制率有劑量的依賴性，在1.00×10-10mol/L～1.00×10-5mol/L的劑量范圍內(nèi)，藥物濃度與流感假病毒抑制率呈正相關(guān)，與病毒釋放量呈負(fù)相關(guān)。奧司他韋和奧司他韋酸對假病毒模型的IC50分別為1.07×10-8mol/L和1.82×10-9mol/L，證明流感假病毒模型構(gòu)建

10、成功。
　　結(jié)果二：甲型H1N1流感假病毒模型的應(yīng)用
　　1、血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示制備的假病毒能夠與甲型 H1N1流感病毒免疫血清發(fā)生中和作用，免疫血清的IC50在1:320～1:640之間，而對VSV-G假病毒基本無中和能力，證明制備的流感假病毒具有與流感病毒相似的生物學(xué)功能，該假病毒模型可用于流感病毒免疫血清的中和效價(jià)評價(jià)。2、假病毒模型評價(jià)化學(xué)藥物帕拉米韋結(jié)果顯示，模型陽性對照組 VSV-G假病毒的抑制率不受帕拉米韋影

11、響，可以排除藥物對本模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)其他因素的影響；帕拉米韋對制備的流感假病毒的抑制率有劑量依賴性，在1.00×10-10mol/L～1.00×10-5mol/L的劑量范圍內(nèi)，藥物濃度與流感假病毒抑制率呈正相關(guān)，與病毒釋放量呈負(fù)相關(guān)。帕拉米韋對假病毒模型的IC50為2.00×10-11mol/L，該假病毒模型可用于抗流感病毒化學(xué)藥帕拉米韋的藥效評價(jià)。
　　3、通過經(jīng)典的雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)，將不同劑量的板藍(lán)根藥材提取液與流感病毒混合后接

12、種至雞胚，病毒活性被明顯抑制。通過NA酶活性測定實(shí)驗(yàn)評價(jià)板藍(lán)根藥材提取液的抗流感病毒活性，NA酶活抑制率與板藍(lán)根藥材提取液濃度呈正相關(guān)，而抑制率轉(zhuǎn)換成幾率單位后，對數(shù)濃度與反應(yīng)函數(shù)呈直線關(guān)系，回歸方程Y(幾率單位)＝6.822+1.9168×Log(濃度)，R=0.9748。板藍(lán)根藥材提取液對NA酶活具有抑制能力，量效關(guān)系呈線性關(guān)系。利用構(gòu)建的流感假病毒模型評價(jià)板藍(lán)根藥材提取液的抗流感病毒活性，結(jié)果顯示板藍(lán)根藥材提取液對所制備的H1N1

13、流感假病毒具有抑制作用，且對假病毒RLA值的50％抑制濃度為10-5g/mL，而模型陽性對照組VSV-G假病毒的抑制率不受板藍(lán)根藥材提取液的影響。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了A/California/04/2009（H1N1）流感病毒亞型的重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　2、確定了適用于本研究實(shí)驗(yàn)體系的包裝細(xì)胞（293T）和宿主細(xì)胞（HEK293）。
　　3、成功構(gòu)建了甲型H1N1流感假病毒模型，并經(jīng)陽性藥給予驗(yàn)證確認(rèn)。