梔子苷對(duì)甲型H1N1流感病毒抑制效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察梔子苷對(duì)甲型H1N1流感病毒感染馬丁達(dá)比犬腎上皮(MDCK)細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effects，CPE)的抑制作用;探討梔子苷對(duì)甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎模型肺部炎癥及肺組織內(nèi)病毒復(fù)制的影響。
　　方法:體外實(shí)驗(yàn)，采用MTT法判定梔子苷對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用，以帕拉米韋為陽(yáng)性對(duì)照藥，根據(jù)MTT比色值(OD)，在不同給藥方式（預(yù)防給藥、直接滅活及治療給藥）及不同藥物劑量干預(yù)下，觀測(cè)梔子苷對(duì)甲型H1

2、N1流感病毒(A/Jiangsu/1/2009(NT0901))感染MDCK細(xì)胞的CPE的抑制作用，計(jì)算梔子苷對(duì)甲型H1N1流感病毒的抑制效率;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，6～8周齡ICR小鼠按照隨機(jī)原則分為對(duì)照組、病毒感染組、梔子苷低劑量(5 mg/kg)治療組、梔子苷中劑量(10 mg/kg)治療組、梔子苷高劑量(20 mg/kg)治療組、帕拉米韋(30 mg/kg)治療組及聯(lián)合治療組（20 mg/kg梔子苷+30 mg/kg帕拉米韋），每組10只。

3、第0天，小鼠在乙醚麻醉后予以NT0901病毒滴鼻攻擊建立甲型H1N1流感病毒模型，從病毒攻擊后第1天開(kāi)始，予以藥物腹腔注射，每天1次，連續(xù)兩周。每日觀察并記錄小鼠一般情況、體重變化率及存活率;第5天取肺組織測(cè)定小鼠肺指數(shù);分別于第3天和第6天取肺組織測(cè)定肺內(nèi)病毒滴度的變化;第6天取肺組織進(jìn)行肺組織病理石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察肺組織炎癥浸潤(rùn)情況，采用免疫組化檢測(cè)肺組織內(nèi)甲型H1N1流感病毒核蛋白（nucleoprotein，

4、NP）的表達(dá)，并用Image pro plus6.0軟件就NP陽(yáng)性染色面積/基底膜長(zhǎng)度比值進(jìn)行比較;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠肺組織勻漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10的水平。
　　結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梔子苷對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度TD50(mediantoxic dose)＞1040μmol/L;在預(yù)防、直接滅活及治療給藥方式下，梔子苷對(duì)NT0901病毒感染MDCK細(xì)胞

5、的半數(shù)有效藥物濃度EC50(concentration for50％ ofmaximal effect)分別為91.90、96.25、87.68μmol/L。在不同給藥方式下，梔子苷對(duì)CPE有明顯抑制作用(P＜0.05)，且呈劑量依賴性;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成功建立了甲型H1N1流感病毒(A/Jiangsu/1/2009(NT0901))小鼠肺炎模型，梔子苷各劑量組小鼠肺指數(shù)、肺內(nèi)病毒滴度較病毒組顯著降低(P＜0.05)。肺組織HE染色結(jié)

6、果顯示，病毒感染組小鼠肺臟正常肺組織結(jié)構(gòu)消失，支氣管、細(xì)支氣管壁及其周圍組織和小葉間隔等肺間質(zhì)充血水腫，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，而梔子苷20 mg/kg治療組炎性浸潤(rùn)狀況則明顯減輕;免疫組化結(jié)果顯示，梔子苷10、20 mg/kg治療組小鼠肺組織NP陽(yáng)性染色面積/基底膜長(zhǎng)度比值與病毒感染組相比顯著減少(P＜0.05)。肺組織勻漿ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示，梔子苷20 mg/kg治療組TNF-α、IFN-γ、IL-6水平較病毒組顯著降低(P＜0.0