甲型H1N1流感病毒重要抗原HA1、NAe蛋白的表達(dá)及應(yīng)用.pdf

1、近些年來,用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)甲型流感病毒表面抗原HA和NA進(jìn)行患者血清抗體檢測(cè)是診斷疾病的重要手段。國(guó)內(nèi)外對(duì)流感病毒表面抗原血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA的表達(dá)進(jìn)行了不少研究,但仍存在不少的問題。如對(duì)表達(dá)系統(tǒng)的選擇,如何增加表達(dá)量及表達(dá)后選擇何種純化方式才有利于提高表達(dá)蛋白的濃度和純度等。國(guó)內(nèi)外用于流感病毒表面抗原表達(dá)系統(tǒng)主要包括真核表達(dá)體系、無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及原核表達(dá)體系。真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白易純化、活性不受影響,但表達(dá)量低、成本高且

2、細(xì)胞不易于培養(yǎng);無細(xì)胞表達(dá)研究技術(shù)還不夠成熟,很難推廣應(yīng)用;原核表達(dá)體系的表達(dá)量高,操作方便,省時(shí),常?？捎糜诖罅勘磉_(dá),表達(dá)產(chǎn)物存在于包涵體,為不溶性顆粒,可通過沉淀進(jìn)行純化,為國(guó)內(nèi)主要應(yīng)用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。但原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全長(zhǎng)基因蛋白,出現(xiàn)表達(dá)量低、純度低,免疫活性弱等不足。研究發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)系統(tǒng)中,蛋白的分子結(jié)構(gòu)及其特性是影響蛋白表達(dá)的重要因素,表達(dá)的蛋白為跨膜蛋白時(shí),蛋白的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為疏水性,影響蛋白表達(dá)量、純度、免疫活性。此外

3、,基因信號(hào)肽序列干擾原核表達(dá)系統(tǒng)的識(shí)別,影響表達(dá)效果。
　　研究目的：
　　本研究包括甲型H1N1流感病毒HA1和NAe的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用研究?jī)蓚€(gè)部分。
　　由于甲型H1N1流感病毒HA和NA均為跨膜蛋白,不利于蛋白的表達(dá)及純化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)其全長(zhǎng)基因表達(dá)的蛋白量低、免疫活性差。因此本研究的第一部分是在前期研究基礎(chǔ)上,對(duì)已克隆測(cè)序的甲型H1N1流感病毒HA和NA全長(zhǎng)基因進(jìn)行改造,去除其信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),研究HA1

4、和NAe基因在原核表達(dá)體系中蛋白表達(dá)量及其純化后的免疫活性。
　　由于檢測(cè)患者血清抗體是診斷甲流的重要手段,因此本研究第二部分進(jìn)一步研究改造后的HA1重鏈蛋白及NAe單體亞基蛋白在檢測(cè)患者血清抗體的作用,探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　研究方法：
　　第一部分在我們前期研究的廣東省2009年首株甲型H1N1流感病毒的HA和NA全長(zhǎng)基因克隆基礎(chǔ)上,通過PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增,去除血凝素和神經(jīng)氨酸酶的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),獲得重要抗原

5、HA1、NAe基因,克隆到原核表達(dá)載體PET-32a(+)并轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10大腸桿菌,菌落PCR后挑取陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng),提取純化重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR、質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞,異丙基-β-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá),并用SDS-PAGE研究蛋白表達(dá)效率,IDA His Bind樹脂純化表達(dá)蛋白,Western blot對(duì)蛋白免疫活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　第二部分應(yīng)用Western blot檢測(cè)

6、技術(shù)比較純化前后重組融合蛋白的免疫特性,并檢測(cè)34例臨床血清標(biāo)本中甲流IgG和IgM抗體,其中IgM抗體檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附法抗流感病毒A型抗體IgM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分
　　1)電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在約1000bp及1300bp處顯示明顯的條帶,分別與預(yù)期的HA1、NAe基因片段大小相符;
　　2)PCR、質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒PET-32a-HA1、PET-32

7、a-NAe構(gòu)建成功;
　　3)SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)產(chǎn)物在分子量約68KD及72KD處可見明顯誘導(dǎo)蛋白條帶,其分子量大小與預(yù)期融合表達(dá)蛋白分子量大小相符,無IPTG誘導(dǎo)組未見蛋白條帶;
　　4)表達(dá)蛋白用IDA His Bind樹脂試劑盒純化后獲得了高濃度和高純度的HA1-68KD及NAe-72KD重組蛋白;
　　5)Western blot檢測(cè)證實(shí)在重組蛋白與甲流病人血清結(jié)合的PVDF膜上可見明顯化學(xué)發(fā)光條帶,

8、而正常人檢測(cè)無發(fā)光條帶顯示,表明表達(dá)蛋白具有較好的抗原活性。
　　第二部分
　　1)在Western blot檢測(cè)中,純化前后的重組蛋白均可與甲流患者血清的抗體結(jié)合產(chǎn)生明顯的特異性免疫反應(yīng)條帶;
　　2)34例臨床標(biāo)本中,表達(dá)蛋白檢測(cè)顯示,IgG抗體陽(yáng)性28例,陰性6例;IgM抗體陽(yáng)性1例,陰性33例;
　　3)抗流感病毒A型抗體IgM檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顯示IgM抗體可疑陽(yáng)性1例,陰性33例。
　　結(jié)論：