甲型H1N1流感病毒重要抗原HA1、NAe蛋白的表達及應(yīng)用.pdf

1、近些年來,用基因工程技術(shù)克隆表達甲型流感病毒表面抗原HA和NA進行患者血清抗體檢測是診斷疾病的重要手段。國內(nèi)外對流感病毒表面抗原血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA的表達進行了不少研究,但仍存在不少的問題。如對表達系統(tǒng)的選擇,如何增加表達量及表達后選擇何種純化方式才有利于提高表達蛋白的濃度和純度等。國內(nèi)外用于流感病毒表面抗原表達系統(tǒng)主要包括真核表達體系、無細胞表達系統(tǒng)及原核表達體系。真核表達系統(tǒng)表達的蛋白易純化、活性不受影響,但表達量低、成本高且

2、細胞不易于培養(yǎng);無細胞表達研究技術(shù)還不夠成熟,很難推廣應(yīng)用;原核表達體系的表達量高,操作方便,省時,常?？捎糜诖罅勘磉_,表達產(chǎn)物存在于包涵體,為不溶性顆粒,可通過沉淀進行純化,為國內(nèi)主要應(yīng)用的蛋白表達系統(tǒng)。但原核表達系統(tǒng)表達全長基因蛋白,出現(xiàn)表達量低、純度低,免疫活性弱等不足。研究發(fā)現(xiàn)原核表達系統(tǒng)中,蛋白的分子結(jié)構(gòu)及其特性是影響蛋白表達的重要因素,表達的蛋白為跨膜蛋白時,蛋白的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為疏水性,影響蛋白表達量、純度、免疫活性。此外

3、,基因信號肽序列干擾原核表達系統(tǒng)的識別,影響表達效果。
　　研究目的：
　　本研究包括甲型H1N1流感病毒HA1和NAe的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用研究兩個部分。
　　由于甲型H1N1流感病毒HA和NA均為跨膜蛋白,不利于蛋白的表達及純化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)其全長基因表達的蛋白量低、免疫活性差。因此本研究的第一部分是在前期研究基礎(chǔ)上,對已克隆測序的甲型H1N1流感病毒HA和NA全長基因進行改造,去除其信號肽和跨膜結(jié)構(gòu),研究HA1

4、和NAe基因在原核表達體系中蛋白表達量及其純化后的免疫活性。
　　由于檢測患者血清抗體是診斷甲流的重要手段,因此本研究第二部分進一步研究改造后的HA1重鏈蛋白及NAe單體亞基蛋白在檢測患者血清抗體的作用,探討其臨床應(yīng)用價值。
　　研究方法：
　　第一部分在我們前期研究的廣東省2009年首株甲型H1N1流感病毒的HA和NA全長基因克隆基礎(chǔ)上,通過PCR引物設(shè)計及擴增,去除血凝素和神經(jīng)氨酸酶的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu),獲得重要抗原

5、HA1、NAe基因,克隆到原核表達載體PET-32a(+)并轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10大腸桿菌,菌落PCR后挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng),提取純化重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR、質(zhì)粒酶切和測序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細胞,異丙基-β-d-硫代半乳糖苷誘導表達,并用SDS-PAGE研究蛋白表達效率,IDA His Bind樹脂純化表達蛋白,Western blot對蛋白免疫活性進行檢測。
　　第二部分應(yīng)用Western blot檢測

6、技術(shù)比較純化前后重組融合蛋白的免疫特性,并檢測34例臨床血清標本中甲流IgG和IgM抗體,其中IgM抗體檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附法抗流感病毒A型抗體IgM檢測結(jié)果進行比較分析。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分
　　1)電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,在約1000bp及1300bp處顯示明顯的條帶,分別與預期的HA1、NAe基因片段大小相符;
　　2)PCR、質(zhì)粒雙酶切和測序鑒定證實重組質(zhì)粒PET-32a-HA1、PET-32

7、a-NAe構(gòu)建成功;
　　3)SDS-PAGE電泳顯示表達產(chǎn)物在分子量約68KD及72KD處可見明顯誘導蛋白條帶,其分子量大小與預期融合表達蛋白分子量大小相符,無IPTG誘導組未見蛋白條帶;
　　4)表達蛋白用IDA His Bind樹脂試劑盒純化后獲得了高濃度和高純度的HA1-68KD及NAe-72KD重組蛋白;
　　5)Western blot檢測證實在重組蛋白與甲流病人血清結(jié)合的PVDF膜上可見明顯化學發(fā)光條帶,

8、而正常人檢測無發(fā)光條帶顯示,表明表達蛋白具有較好的抗原活性。
　　第二部分
　　1)在Western blot檢測中,純化前后的重組蛋白均可與甲流患者血清的抗體結(jié)合產(chǎn)生明顯的特異性免疫反應(yīng)條帶;
　　2)34例臨床標本中,表達蛋白檢測顯示,IgG抗體陽性28例,陰性6例;IgM抗體陽性1例,陰性33例;
　　3)抗流感病毒A型抗體IgM檢測試劑盒檢測顯示IgM抗體可疑陽性1例,陰性33例。
　　結(jié)論：