H1N1和H3N2亞型豬流感病毒的拯救及其致病基因的分析.pdf

1、豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，該病以傳染性強、發(fā)病率高和死亡率低等為特點。豬流感病毒為A型流感病毒，該病毒的基因組為分節(jié)段的單股負鏈RNA。這一特點使病毒能通過基因突變和基因重配不斷進化。NS1和PB1-F2蛋白是流感病毒編碼的兩個重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。本研究開展了H1和H3亞型豬流感病毒流行情況的血清學調(diào)查，并分析了NS1和PB1-F2蛋白的突變及基因重配對古典豬流感病毒生物學特性的影響。
　　 1.待宰肉豬H1

2、爭H3亞型豬流感病毒抗體血清學檢測為了了解待宰肉豬中H1和H3亞型豬流感病毒的流行情況，采用血凝抑制試驗對采集于南京市某3個肉聯(lián)廠的483份血清樣品進行H1和H3亞型豬流感病毒的抗體檢測。實驗結(jié)果表明，H1亞型抗體陽性的血清樣品為32份，陽性率為6.6％;H3亞型抗體陽性的血清樣品為53份，陽性率為10.9％; H1和H3亞型均為陽性的血清樣品2份，陽性率為0.4％。實驗結(jié)果說明被調(diào)查的待宰肉豬受到H1或H3亞型豬流感病毒不同程度的感染

3、。
　　 2.豬流感病毒的拯救及體外生物學特性的分析為了建立豬流感病毒拯救的反向遺傳操作系統(tǒng)，用RT-PCR方法分別擴增出豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2004(GD/04)和A/Swine/Shanghai/1/2005(SH/05)的8個基因片段，通過與雙向轉(zhuǎn)錄表達載體pBD連接，構(gòu)建成含流感病毒8個基因片段的轉(zhuǎn)錄表達重組質(zhì)粒。將含流感病毒8個基因片段的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，拯救出GD/04和SH/

4、05病毒。拯救出的病毒分別命名為rGD/04和rSH/05。對rGD/04和rSH/05病毒的生長曲線、病毒蝕斑形態(tài)、病毒NP蛋白在細胞內(nèi)的分布和全基因組測序等進行分析后證實拯救病毒的體外生物學特性和基因組均與親本病毒保持一致。實驗結(jié)果說明成功拯救出GD/04和SH/05病毒。GD/04和SH/05病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.古典豬流感NS1蛋白突變病毒的構(gòu)建及對小鼠的致病性分析序列分析表明

5、，古典豬H1N1流感病毒的NS1蛋白在過去80年間不斷進化，最顯著的特征為該蛋白C-端最末尾4個氨基酸殘基序列的變化和該蛋白C-端末尾11個氨基酸殘基的缺失。然而，發(fā)生在NS1蛋白C-端末尾的這些變化對古典豬H1N1流感病毒的毒力是否有影響至今仍不清楚。以反向遺傳學技術(shù)為基礎(chǔ)，我們以古典豬H1N1病毒A/Swine/Shanghai/1/2005為框架構(gòu)建出3株NS1蛋白突變病毒（RSEV、GSEI和EPEV）和1株野生型病毒(PEQK

6、)，并以小鼠為動物模型分析這些病毒的毒力。實驗結(jié)果表明，RSEV和PEQK病毒都不能在小鼠肺臟中復制;而GSEI和EPEV病毒卻不需要在小鼠體內(nèi)適應(yīng)就能在小鼠肺臟中復制。攻毒后第4天，GSEI和EPEV病毒組小鼠肺臟中的病毒滴度分別為2.3×103 pfu/g和0.7×101 pfu/g。對攻毒后第6天的GSEI和EPEV病毒組小鼠的肺臟進行病理分析后發(fā)現(xiàn)這兩株病毒均能在小鼠肺臟中引起輕度的病毒性肺炎（肺泡壁增厚）。上述實驗結(jié)果說明，古

7、典豬H1N1流感病毒NS1蛋白C-端最末尾4個氨基酸殘基序列GSEI和EPEV與該病毒在小鼠上表現(xiàn)出的毒力相關(guān)且能使該病毒跨越種間屏障從豬傳播給小鼠。
　　 4.古典豬流感PB1-F2蛋白突變病毒的構(gòu)建及對小鼠的致病性分析PB1-F2蛋白是流感病毒PB1基因編碼的一個小分子量非結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明，該蛋白能增強高致病性流感病毒和實驗室小鼠適應(yīng)流感病毒在小鼠模型上的毒力。但PB1-F2蛋白是否也能增強低致病性流感病毒在小鼠模型上的毒

8、力還不清楚。通過反向遺傳學技術(shù)，我們以低致病性的古典豬H1N1流感病毒(PEQK)為框架，構(gòu)建出一株表達PB1-F2蛋白的PEQK-F2病毒。我們先前的實驗表明，PEQK病毒不能在小鼠肺臟中復制，因此我們又以能在小鼠肺臟中復制的GSEI病毒（PEQK病毒的NS1蛋白突變病毒）為框架，構(gòu)建出一株表達PB1-F2蛋白的GSEI-F2病毒。實驗結(jié)果表明，PEQK-F2病毒不能在小鼠肺臟中復制，GSEI-F2病毒在小鼠肺臟中的清除速度比GSEI

9、病毒的快（接毒后第6天仍能在小鼠肺臟中分離到GSEI病毒，而GSEI-F2病毒則在接毒后第4天就分離不到）。上述結(jié)果說明，PB1-F2蛋白不能促使PEQK-F2病毒在小鼠肺臟中復制，但PB1-F2蛋白能加快病毒從肺臟中清除。
　　 5.古典豬流感基因重配病毒的構(gòu)建及對豚鼠的致病性分析本實驗室于2004年和2005年分別分離到兩株豬流感病毒A/Swine/Gongdong/1/2004(GD/04)和A/Swine/Shangha

10、i/1/2005(SH/05)。實驗表明，GD/04病毒能在豚鼠肺臟中復制，而SH/05病毒卻不能。為了分析與GD/04病毒感染豚鼠有關(guān)的基因，本實驗以反向遺傳學技術(shù)為基礎(chǔ)，以SH/05病毒為框架，構(gòu)建出5株含GD/04病毒基因的SH-PB2(GD)、SH-NS(GD)、SH-HA，NA(GD)、SH-PB2，HA，NA(GD)和GH-HA，NA，NS(GD)基因重配病毒，并分析這些基因重配病毒對豚鼠的致病性。攻毒后第3天在豚鼠的氣管和