H3N2亞型豬流感病毒進(jìn)化分析及重組HA1蛋白間接ELISA診斷方法的建立.pdf

1、H3N2亞型豬流感病毒在全世界豬群中廣泛存在,不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且對(duì)人類健康造成威脅.為了了解我國2004～2005年豬流感病毒流行情況,我們對(duì)中國某些省市豬群進(jìn)行豬流感血清學(xué)和病原調(diào)查研究,從1238份豬鼻棉拭子和豬肺、氣管樣品中分離到5株H3N2亞型豬流感病毒. 通過比較發(fā)現(xiàn)分離的5株H3N2亞型豬流感病毒HA和NA基因同源性較高,都達(dá)到99﹪以上.對(duì)其中一株A/Swine/Guangdong/9/05(H

2、3N2)(縮寫SW/GD/9/05)的全基因進(jìn)行克隆、測序,構(gòu)建HA、PB2、NP部分基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化樹,從系統(tǒng)進(jìn)化樹來看它屬于近期人流感病毒分支,通過對(duì)HAl編碼的氨基酸序列和參考毒株進(jìn)行比較,得知其在某些氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變. 將RT-PCR擴(kuò)增得到的全長為1.76kb的HA基因克隆到pMD-18T載體上,篩選、鑒定陽性重組子pMD-HA,以此為模板擴(kuò)增出HAl片段,去除編碼HA信號(hào)肽的核苷酸序列,然后亞克隆到原核表達(dá)載體

3、pET30a上,經(jīng)雙酶切、PCR鑒定,篩選重組表達(dá)質(zhì)粒pET-HA1,經(jīng)序列分析進(jìn)一步驗(yàn)證HAl基因完整.將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-HAl轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(DE3)中,經(jīng)終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示H3N2亞型豬流感病毒HAl基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中己表達(dá),HAl蛋白表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的40﹪,分子量近似42KD.Western-blot檢測結(jié)果表明表達(dá)蛋白具有良好的抗原性. 利用表

4、達(dá)并純化后的重組蛋白作為抗原,建立檢測H3亞型豬流感病毒抗體的間接ELISA,為了優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件,我們用H3亞型豬流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行反應(yīng),最終確定了抗原的最適包被濃度為1.5μg/100μl,最適血清稀釋度為1:100,酶標(biāo)HRP的最適工作濃度為l:1000.該檢測方法不與HlNl、H5Nl、H9N2亞型豬流感病毒及豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病等豬病的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng).與HI作對(duì)比實(shí)驗(yàn),同時(shí)對(duì)來自