豬博卡病毒間接ELISA診斷方法的建立.pdf

1、豬博卡病毒(PBoV)最早于2009年在瑞典被發(fā)現(xiàn)，迄今為止，對(duì)于其傳播方式，侵染機(jī)制，及其基因組功能都不甚明了，但是世界各國(guó)學(xué)者在進(jìn)行該病毒的流行病學(xué)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病毒在PMWS患豬中陽(yáng)性率較高。另外還有學(xué)者提出豬博卡病毒可能與呼吸道疾病病原共感染機(jī)體。目前大多認(rèn)為其基因組編碼3個(gè)開放閱讀框(ORF)分別對(duì)應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、抗原蛋白VP、和非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，VP蛋白為豬博卡病毒主要的抗原蛋白，但變異性較高，非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，編碼一個(gè)

2、相對(duì)保守且高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。目前世界各國(guó)對(duì)該病毒的檢測(cè)也僅僅局限于一些不成熟的PCR檢測(cè)方法，并無血清學(xué)檢測(cè)方法的問世，因而有效的血清學(xué)診斷方法的研究迫在眉睫，本研究成功的在河北地區(qū)病豬體內(nèi)提取出豬博卡病毒基因，分別對(duì)NP1基因和VP2基因進(jìn)行B細(xì)胞線性抗原表位的預(yù)測(cè)分析，并對(duì)保守的NP1基因和截短的相對(duì)保守的VP2基因進(jìn)行克隆表達(dá)，分別將純化的NP1蛋白和VP2截短蛋白作為包被抗原，經(jīng)過優(yōu)化條件和相對(duì)比較建立了快速檢測(cè)豬博卡

3、病毒病的血清學(xué)診斷方法。
　　根據(jù)NCBI系統(tǒng)中GenBank已發(fā)表的豬博卡病毒NP1和VP2基因序列，設(shè)計(jì)合成特異性引物，采用降落PCR技術(shù)擴(kuò)增NP1基因和截短的VP2基因序列，克隆后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確后進(jìn)行克隆載體與加酶切位點(diǎn)的目的片段的連接轉(zhuǎn)化，并分別將質(zhì)粒命名為PMD-NP1和PMD-VP2。對(duì)重組質(zhì)粒PMD-NP1和PMD-VP2進(jìn)行雙酶切得到帶酶切位點(diǎn)的NP1基因和截短的VP2基因并將其與原核表達(dá)載體pET32a連接，

4、構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a-NP1和pET32a-VP2。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳可分別檢測(cè)到分子質(zhì)量約為44ku和35 ku的蛋白，與預(yù)期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中，同時(shí)在包涵體中也大量存在。利用原核表達(dá)載體pET32a上帶有的His標(biāo)簽對(duì)pET32a-NP1和pET32a-VP2重組蛋白進(jìn)行純化，純化蛋白經(jīng)Western-blotting結(jié)果顯示，重組蛋白與PBOV陽(yáng)性血清具有良好的反應(yīng)原性。表明分

5、子質(zhì)量約43 ku和37 ku的蛋白即為目的蛋白。
　　以純化的兩種重組蛋白分別作為包被抗原，通過對(duì)各自反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)PBoV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，并比較兩種ELISA檢測(cè)方法。優(yōu)化結(jié)果顯示，以NP1蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為4μg/mL;封閉液為2％的明膠工作液;陰陽(yáng)性血清最佳稀釋度為1∶80，二抗的最佳稀釋度為1∶1000，底物顯色時(shí)間為10 min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽(yáng)

6、性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)(CV)均值都小于10％，而以VP2蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為2μg/mL;封閉液為2％的明膠工作液;陰陽(yáng)性血清最佳稀釋度為1∶80，酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶1000，底物顯色時(shí)間為15 min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)(CV)均小于10％，說明該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，同時(shí)通過比較發(fā)現(xiàn)