豬圓環(huán)病毒2型流行株糖基化位點突變對病毒復制的影響.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecirovirus type2，PCV2)是引發(fā)豬圓環(huán)病毒相關病的病原，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)集約化以及規(guī)?；难杆侔l(fā)展，豬圓環(huán)病毒給豬場帶來的損失也逐漸嚴重。PCV2在我國首次發(fā)現(xiàn)是在2000年，后迅速遍布全國，給我國養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的損失。目前，疫苗注射成為預防PCV2的最有效方法，市場上流行各種疫苗，滅活疫苗的研究比較成熟，但是病毒復制滴度低成為阻礙滅活疫苗發(fā)展的主要因素，本研究通過糖基化位點突變提高PCV2

2、的復制滴度，為后續(xù)疫苗的研制奠定基礎。本論文主要從三個方面進行論述:
　　1.河北部分地區(qū)2014-2016年PCV2流行病學的調(diào)查
　　為了解PCV2在河北省豬群中的流行情況，2014-2016年期間，對河北省部分地區(qū)近100家規(guī)模化豬場進行PCV2流行病學調(diào)查。采集PCV2感染豬的肺臟、腎臟及淋巴結(jié)，采用PCR技術(shù)對PCV2進行檢測，同時對PCV2全基因組進行了擴增，并利用軟件MegAlign和MEGA6.06對測序結(jié)果

3、進行了相關分析。結(jié)果表明，2014-2016年調(diào)查的近100家豬場PCV2感染率均較高，測序發(fā)現(xiàn)分析的62株序列只有兩種類型，有59株屬于PCV2d，只有3株屬于PCV2b，表明河北省部分地區(qū)的主要流行毒株為PCV2d，序列同源性普遍較高，ORF2的氨基酸序列有16處發(fā)生突變，。河北省部分地區(qū)的流行病學調(diào)查為后續(xù)研究奠定了基礎。
　　2.PCV2流行株的分離與鑒定
　　針對河北省部分地區(qū)豬場PCV2流行病學的調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV2

4、d為主要流行毒株，在此基礎上，選取一株PCV2d，命名為PCV2RC160307，感染PK-15細胞進行細胞分離，盲傳至F8代通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)、間接免疫熒光(Indirect immuno-Fluores cence Assay，IFA)及過氧化物酶單層試驗(Immuno-Peroxidase Monolayer Assay，IPMA)進行驗證，經(jīng)驗證F8代的細胞毒提取

5、得到的核酸PCV2檢測為陽性，IFA以及IPMA細胞均呈陽性反應，證實PCV2RC160307能夠在PK15細胞中穩(wěn)定存在并復制，為PCV2的進一步研究打下基礎。
　　3.PCV2流行株感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救
　　為提高豬圓環(huán)病毒的滴度，研究室利用已成功分離的一株PCV2d流行毒株PCV2RC160307為模板，通過融合PCR突變其Rep蛋白上的一個N-糖基化位點，并成功構(gòu)建自身環(huán)化感染性克隆HT-RC160307PCV