基于質(zhì)粒表達(dá)的siRNA對(duì)豬圓環(huán)病毒2型體內(nèi)外復(fù)制的抑制效應(yīng).pdf

1、分類號(hào)：S墨5：三密級(jí)：公玨一單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號(hào)：2QQ墨壘魚Q基于質(zhì)粒表達(dá)的siRNA對(duì)豬圓環(huán)病毒2型體內(nèi)外復(fù)制的抑制效應(yīng)InhibitionofPlasmidbasedsiRNAontheReplicationofPorcineCircovirusType2(PCV2)inVivoandinVitro學(xué)位申請(qǐng)人：李曼指導(dǎo)教師：宋勤葉教授學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一一年五月二十九日

2、＼刪l㈣㈣叭㈣n㈧㈨刪噬I堅(jiān)‘Y1^M‘刁V摘要豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)是危害當(dāng)今全球養(yǎng)豬生產(chǎn)的最重要的免疫抑制性疫病。目前仍沒(méi)有防治該病的理想疫苗和藥物，因此研究預(yù)防和治療PCVAD的新制劑具有重要的理論和實(shí)踐意義。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈小干擾(siIⅢA)引起的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，該技術(shù)在傳染性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病等的治療研究領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。本研究構(gòu)建了PCV2特異

3、的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，分析了其對(duì)PCV2增殖和致病性的抑制作用。針對(duì)PCV2的rep和cap基因，篩選了10個(gè)siRNA靶序列，設(shè)計(jì)并合成了10對(duì)編碼PCV2特異的shRNA的DNA寡核苷酸和l對(duì)PCV2非特異(SCR)的shRNA的DNA寡核苷酸。將ll對(duì)DNA寡核苷酸退火形成雙鏈，克隆到siRNA表達(dá)質(zhì)粒pGensil1的U6啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了PCV2特異的siRNA表達(dá)質(zhì)粒(pGensilC123、C297、C490、C563、C

4、645、R148、R259、R295、R484、R601)和對(duì)照質(zhì)粒(pGensilSCR)。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將構(gòu)建的siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK一15細(xì)胞，20h后感染500TCID50的PCV2。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimeFQPCR)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)、蛋白免疫印記(Westernblot)和免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)等技術(shù)檢測(cè)病毒DNA、mRNA及蛋白的合成與表達(dá)情況。結(jié)果表明，構(gòu)建的P

5、CV2特異的siRNA表達(dá)質(zhì)粒均能不同程度地抑制PCV2DNA、mRNA及Rep與Cap蛋白在PK15細(xì)胞內(nèi)的合成，其中針對(duì)C297、C490和R259三個(gè)靶位的siRNA的抑制效果更好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后16hfl0可抑制PCV2的復(fù)制，且直到接毒后72h仍有明顯的抑制作用；當(dāng)siRNA表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量為1pg時(shí)，病毒DNA濃度顯著低于轉(zhuǎn)染025Pg、05lag時(shí)的濃度；針對(duì)兩個(gè)或三個(gè)靶位的siRNA表達(dá)質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)染PK15

6、細(xì)胞對(duì)PCV2的抑制作用顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果提示PCV2特異的siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)病毒的抑制作用具有長(zhǎng)效性和劑量依賴性，針對(duì)不同靶位的siRNA表達(dá)質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)染對(duì)PCV2具有抑制協(xié)同效應(yīng)。將128只8周齡BALB／c隨機(jī)分為8組，每組16只。第l、2組分別為只感染病毒的陽(yáng)性對(duì)照(PC)組和不感染病毒的陰性對(duì)照(NC)組；第3、6組分別為空質(zhì)粒和SCR對(duì)照組，第4、5組為接種一種質(zhì)粒組，第7、8組為兩種質(zhì)粒混合組。其中第3～7組先接種質(zhì)粒2

7、4h后感染PCV2；第8組先感染PCV2，24h后接種質(zhì)粒。質(zhì)粒和病毒均通過(guò)腹腔與鼻腔途徑接種，質(zhì)粒接種劑量為50肛∥只，PCV2(105TCIDs401mL)的感染劑量為01mL／只。結(jié)果PCV2感染21d后，接種siRNA表達(dá)質(zhì)粒的各組小鼠的體重均顯著高于PC、空質(zhì)粒和SCR對(duì)照組的體重(PO05)。與PC、空質(zhì)粒和SCR對(duì)照組相比，接種siRNA表達(dá)質(zhì)粒組的抗體水平、血清中PCV2核酸檢出率以及組織中的PCV2載量均顯著降低(P0