人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA體系構建及其抑制效應觀察.pdf

1、腎臟纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展到后期的病理學改變，其本質(zhì)是以細胞外基質(zhì)過度積聚為特征的病理過程。Ⅰ型膠原在細胞外基質(zhì)聚集中起著不可或缺的作用，其中編碼為COL1A1的αl(Ⅰ)起著主要的生物學作用。利用RNA干涉技術下調(diào)Ⅰ型膠原基因的過度表達，以期成為延緩腎臟纖維化的新方法。 第一部分：人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA的設計篩選和鑒定 目的：針對Ⅰ型膠原αL(Ⅰ)鏈設計并篩選人鼠同源Ⅰ型膠原 siRNA(COL1A1-s

2、iRNA)，并證實其有效性。 方法：根據(jù)已知的設計原則，利用軟件設計人鼠完全同源的一對Ⅰ型膠原siRNA序列。將非特異性帶有熒光的siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細胞，顯微鏡下觀察大鼠系膜細胞轉(zhuǎn)染效率。直接將Ⅰ型膠原siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細胞，利用RT-PCR的方法觀察對大鼠系膜細胞Ⅰ型膠原蛋白表達的抑制作用。 結果：大鼠系膜細胞可以轉(zhuǎn)染非特異性siRNAI型膠原，從而可以作為siRNA實驗研究的載體，轉(zhuǎn)染效率約為53.9％。

3、將Ⅰ型膠原siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細胞，與空白對照組及MOCK組比較，各siRNA組均可見特異性513bpCOL1A1基因條帶，并隨siRNA濃度增加，條帶逐漸減暗。可見Ⅰ型膠原siRNA使Ⅰ型膠原表達下調(diào)，并具劑量依賴性。 結論：所設計的Ⅰ型膠原siRNA為人與大鼠完全同源的siRNA序列，所有堿基完全匹配?？梢猿晒D(zhuǎn)染到大鼠系膜細胞，并有效抑制Ⅰ型膠原在細胞內(nèi)的表達。 第二部分人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA表達載體的構建

4、 目的：建立Ⅰ型膠原siRNA表達質(zhì)粒，使其作用時間更長，表達更穩(wěn)定。 方法：將所確定的Ⅰ型膠原siRNA作為靶點，合成64 nt的寡核苷酸，經(jīng)過退火、T4多聚核苷酸激酶處理，與經(jīng)BamH Ⅰ和PstⅠ酶切的線性化質(zhì)粒pCGPU6/GFP/Neo定向連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，并經(jīng)過PCR和測序鑒定。將構建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細胞，RT-PCR觀察抑制作用。 結果：與空白對照組、mock組電泳條帶比較，各siRNA質(zhì)粒

5、組均可見特異性513bp COL1A1基因條帶，并隨siRNA質(zhì)粒濃度增加，條帶逐漸減暗?？梢姠裥湍z原siRNA質(zhì)粒同樣使Ⅰ型膠原表達下調(diào)，效果顯著，并具劑量依賴性。 結論：采用質(zhì)粒載體的方法同樣可以達到抑制Ⅰ型膠原形成的作用，而且表達更穩(wěn)定，作用更顯著。 第三部分 人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA對TGF-β<,1>誘導Ⅰ型膠原表達的抑制作用 目的：觀察病理情況下Ⅰ型膠原siRNA對人TGF-β<,1>誘導Ⅰ型膠原表

6、達的抑制作用。 方法：選用人TGF-β<,1>誘導大鼠系膜細胞Ⅰ型膠原表達，觀察表達效果。并利用Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒抑制其表達。 結果：經(jīng)TGF-β<,1>誘導的Ⅰ型膠原基因的表達明顯增強，并隨TGF-β<,1>劑量的增大，效果更顯著。經(jīng)刺激因子TGF-β<,1>誘導后，再轉(zhuǎn)染Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒，可見與空白對照組、mock組比較，各刺激因子組條帶逐漸增強，及單純予以刺激因子誘導的相對應各組比較，轉(zhuǎn)染siRNA組條帶