萊菔硫烷對肺癌干細(xì)胞的抑制效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 萊菔硫烷（Sulforaphane，SF）是從綠花椰菜或綠花椰菜幼芽中提取的一種經(jīng)葡糖異硫氰酸鹽轉(zhuǎn)化的天然化合物，傳統(tǒng)上作為預(yù)防腫瘤的化學(xué)藥物。動物實(shí)驗(yàn)表明，萊菔硫烷可阻斷化學(xué)物誘發(fā)腫瘤的起始階段，日常膳食中的萊菔硫烷足以顯著降低細(xì)胞PhIP2DNA加合物的形成。萊菔硫烷可防止二甲基苯蒽(7，12-dimethyl benz(a) anthracene，DMBA)誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌癌前損害和大鼠乳腺腫瘤的發(fā)生，使

2、DMBA誘導(dǎo)的SD雌性大鼠腫瘤的發(fā)生率降低、腫瘤的數(shù)量減少、瘤重減輕、腫瘤生長緩慢。萊菔硫烷通過抑制人、鼠的細(xì)胞色素P450和苯并(a)芘與DNA結(jié)合，從而改變致癌物代謝。以往的文獻(xiàn)證實(shí)萊菔硫烷能將前致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化為致癌物的I相代謝酶，誘導(dǎo)促進(jìn)致癌物排出的Ⅱ相代謝酶。萊菔硫烷是最有潛力的Ⅱ相酶誘導(dǎo)物，它誘導(dǎo)的Ⅱ相酶基因，如GST和NQO1也依賴于Nrf2。給Nrf2缺失鼠和野生型鼠萊菔硫烷后，用DNA矩陣方法檢測鼠小腸中Nrf2依賴基因的

3、表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量Nrf2調(diào)節(jié)的解毒酶、抗氧化蛋白和降低毒物毒性的細(xì)胞保護(hù)蛋白。體內(nèi)和體外的研究發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷刺激Raf-1激酶的活性，表明萊菔硫烷對ARE依賴的Ⅱ相解毒酶的誘導(dǎo)作用受MAPK(mitogen-activated protein kinase)路徑的調(diào)節(jié)，也包括萊菔硫烷對Raf-1激酶的直接刺激和活化作用。萊菔硫烷不能干預(yù)AP-1(activator protein1)的轉(zhuǎn)錄活性，但是，可以通過增加細(xì)胞間信號調(diào)節(jié)激酶的

4、磷酸化和激酶活性提高AP-1依賴的Ⅱ相酶表達(dá)。
　　 除了解毒、減毒功能外，萊菔硫烷通過不同的信號通路調(diào)控多種細(xì)胞活動，包括抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制血管生成和轉(zhuǎn)移。環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COx-2)是花生四烯酸代謝過程中重要的限速酶。腫瘤組織COX-2表達(dá)增加，在結(jié)腸、直腸腺瘤及腺癌、胃癌、胰腺癌等多種癌癥中，COX-2蛋白及mRNA水平較正常組織升高。COX-2表達(dá)上調(diào)與腫瘤的

5、發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，萊菔硫烷可下調(diào)鼠巨噬細(xì)胞COX-2的表達(dá)，其抑制作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。COX-2啟動子區(qū)域的順式作用元件上存在NFκB和C/EBP(CCAAT/enhancer-binding protein)β結(jié)合位點(diǎn)，萊菔硫烷主要是通過抑制NFκB的活性而抑制脂多糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
　　 另外，萊菔硫烷可引起HT-29細(xì)胞凋亡與P53蛋白表達(dá)無關(guān)，而與bcl-2基因家族中引起細(xì)胞死亡的bax過度表達(dá)有關(guān)。bax是一種胞

6、質(zhì)蛋白，一部分可轉(zhuǎn)移到線粒體，并引起線粒體釋放細(xì)胞色素C，最終活化Caspase級聯(lián)反應(yīng)引起凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，bax過度表達(dá)能降解cdk(cyclin-dependent kinase)的抑制物P27，進(jìn)而誘導(dǎo)cdk和caspase的活化。這說明萊菔硫烷可抑制腫瘤發(fā)生過程中的多個步驟。
　　 腫瘤干細(xì)胞假說認(rèn)為，腫瘤組織由一小部分腫瘤形成和自我更新的腫瘤干細(xì)胞和大部分不能形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞組成。大多數(shù)腫瘤組織中均能鑒別出腫瘤干細(xì)胞

7、，包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌等。這一假說提示傳統(tǒng)上的化療藥物只殺死已分化或分化中的腫瘤細(xì)胞，而這些細(xì)胞占腫瘤組織的大部分，不能產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤干細(xì)胞沒有受影響，故腫瘤通常出現(xiàn)復(fù)發(fā)，這提示去除腫瘤干細(xì)胞是有效的腫瘤治療的關(guān)鍵。腫瘤干細(xì)胞與腫瘤中大多數(shù)量細(xì)胞不同，它對化療藥物耐藥，并在腫瘤治療后促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。包括Wnt/β-catenin在內(nèi)的多條信號通路被認(rèn)為參與了正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞自我更新行為的調(diào)控。研究證實(shí)Wnt/β

8、-catenin是調(diào)控腫瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵信號通路之一。
　　 miRNA是一種長約21-23個堿基的非編碼RNA，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的重要調(diào)節(jié)子，其主要機(jī)制是靶向特異的miRNA序列并抑制其翻譯的激活或促進(jìn)其降解。來自不同實(shí)驗(yàn)室的研究表明，miRNA的調(diào)控范圍非常廣泛，包括發(fā)育、生存周期、代謝和腫瘤發(fā)生。miRNA基因受多種水平調(diào)控以應(yīng)答分化和有絲分裂的激活。一些miRNA表達(dá)于某些特定分化細(xì)胞，而另一些miRNA

9、則在早期發(fā)育過程中特異地表達(dá)于干細(xì)胞或祖細(xì)胞。近年研究表明，miRNA的調(diào)控失常與許多腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，miRNA可作為腫瘤抑制子或原癌基因并參與腫瘤干細(xì)胞的維持與分化。
　　 研究目的:
　　 1.確定萊菔硫烷對肺癌細(xì)胞的效應(yīng);
　　 2.確定萊菔硫烷對體外培養(yǎng)細(xì)胞中肺癌干細(xì)胞的抑制效果
　　 3.確定萊菔硫烷對動物模型中的腫瘤干細(xì)胞的抑制效果。
　　 4.探討萊菔硫烷抑制肺癌干細(xì)胞自我更新

10、的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.不同濃度萊菔硫烷（0-20μmol/L）處理H460和H446細(xì)胞72h后，采用MTT法檢測萊菔硫烷對肺癌細(xì)胞生長的抑制作用;不同濃度萊菔硫烷（5和10μmol/L）處理H460細(xì)胞72h后，采用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測萊菔硫烷對肺癌細(xì)胞凋亡的影響。Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。只有Annexin

11、V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexi

12、n V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
　　 2.采用腫瘤球培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。腫瘤球培養(yǎng)法是利用腫瘤干細(xì)胞能在無血清的培養(yǎng)基中懸浮生

13、長，而分化的腫瘤細(xì)胞不能在其中存活的特征，最早用于腫瘤干細(xì)胞研究的有效方法。腫瘤球內(nèi)腫瘤干細(xì)胞富集，能用各種相關(guān)腫瘤干細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記物鑒定并分離。常規(guī)培養(yǎng)的H460細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，離心，1000rpm，2分鐘，棄上清。加入3ml無菌PBS，輕柔吹散洗滌細(xì)胞沉淀并離心。反復(fù)洗滌3次后加入腫瘤球培養(yǎng)基，制備成單細(xì)胞懸液。測定細(xì)胞濃度并調(diào)整細(xì)胞密度為1500 cells/mL，將單細(xì)胞懸液均勻地轉(zhuǎn)移到超低粘附的6孔板內(nèi)，進(jìn)行原代腫瘤球培養(yǎng)。分

14、為以下4組:空白組、SF1(1μMol/1)、SF2(2μMo1/1)和SF5(5μMol/1)。在腫瘤球培養(yǎng)基中加入不同濃度萊菔硫烷（1.0、2.0和5.0μmol/L）處理H460和H446細(xì)胞7天，期間每3-4天換液1次。處理結(jié)束后在顯微鏡下計數(shù)腫瘤球形成數(shù)量并測定腫瘤球直徑。比較各組間的差異以確定萊菔硫烷對原代肺癌細(xì)胞腫瘤球形成的影響;對原代培養(yǎng)的腫瘤球再次以accutase酶消化為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整為800-1000個細(xì)

15、胞/ml，重新進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)，不加入藥物處理。7d后計數(shù)腫瘤球形成的數(shù)量并測量腫瘤球直徑。
　　 3.萊菔硫烷對肺癌細(xì)胞內(nèi)側(cè)群細(xì)胞(Side population cells，SP cells)比例的影響側(cè)群細(xì)胞是在應(yīng)用Hoechst33342染色和熒光激活細(xì)胞分選時發(fā)現(xiàn)的一小群拒染細(xì)胞。已經(jīng)證實(shí)SP細(xì)胞具有自我更新、分化和高致瘤性的特征，并且發(fā)現(xiàn)其具備干細(xì)胞“永生”和處于靜止?fàn)顟B(tài)的特征，高表達(dá)抗凋亡因子和端粒酶mRNA，而標(biāo)志

16、細(xì)胞增生的MCM7基因mRNA表達(dá)下調(diào)。肺癌的側(cè)群細(xì)胞高表達(dá)ABCG2、AKRICL/C2、TM4SF1、NROBI基因表達(dá)上調(diào)并且具備腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征。SP細(xì)胞是鑒定腫瘤干細(xì)胞的一種簡單有效并且廉價的方法。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342染色法檢測不同濃度萊菔硫烷（1.0和5.0μmol/L）對肺癌細(xì)胞內(nèi)側(cè)群細(xì)胞的影響。
　　 4.不同濃度的萊菔硫烷處理H460細(xì)胞3天后，制備細(xì)胞爬片或提取細(xì)胞總蛋白，采用

17、免疫熒光和蛋白印跡法檢測萊菔硫烷對肺癌多潛能維持因子(Nanog、OCT4、Sox2和c-Myc)的影響。
　　 5.構(gòu)建Nanog啟動子啟動的熒光素酶表達(dá)載體，用以標(biāo)記肺癌干細(xì)胞;建立裸鼠移植瘤模型;采用腹腔注射法，50mg/Kg，1次/天，在活體動物中實(shí)時觀察萊菔硫烷對移植瘤中Nanog陽性細(xì)胞的熒光素酶活性的影響，1次/3天，間接觀察萊菔硫烷對肺癌干細(xì)胞自我更新的影響。
　　 6.采用蛋白印跡法檢測不同濃度萊菔硫烷

18、對Wnt/β-catenin調(diào)控通路的影響;轉(zhuǎn)染S33Y質(zhì)粒，構(gòu)建過表達(dá)活化型β-catenin細(xì)胞株H460-S33Y，觀察萊菔硫烷對H460-S33Y細(xì)胞多潛能維持因子Nanog和c-Myc表達(dá)的影響;
　　 7.采用QPCR和蛋白印跡法檢測萊菔硫烷對miRNA的影響，靶向抑制相關(guān)miRNA后檢測相關(guān)蛋白的影響;采用RNA22在線分析程序和啟動子分析程序等分析相關(guān)miRNA與相關(guān)基因的靶標(biāo)關(guān)系及調(diào)控關(guān)系。
　　 8.

19、采用雙熒光素酶報告基因載體驗(yàn)證miRNA與靶基因的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.萊菔硫烷能有效抑制肺癌細(xì)胞H460和H446，其IC50分別為11.2和9.8μmol/L。萊菔硫烷在高濃度（10μmol/L）下可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(F=36.54，P=0.003)。
　　 2.在體外培養(yǎng)條件下，萊菔硫烷呈劑量依賴性地減少肺癌細(xì)胞H460和H446細(xì)胞的原代腫瘤球體積（H460細(xì)胞:F=30.69，P=0.000;H4

20、46細(xì)胞:F=14.19，P=0.000），抑制其原代腫瘤球形成能力（H460細(xì)胞:F=63.67，P=0.000;H446細(xì)胞:F=128.32，P=0.000）和二代腫瘤球形成(H460細(xì)胞:F=19.46，P=0.000;H446細(xì)胞:F=74.44，P=0.000)。萊菔硫烷在較低的濃度下(1.0μmol/L)即可明顯抑制腫瘤球的形成，在5.0μmol/L時幾乎不能形成腫瘤球。萊菔硫烷抑制腫瘤干細(xì)胞的濃度比抑制腫瘤細(xì)胞的濃度（I

21、C50為～10μmol/L）低至少10倍，提示萊菔硫烷特異地靶向抑制腫瘤干細(xì)胞。原代腫瘤球經(jīng)消化再次進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)后，第2代腫瘤球在沒有加入藥物處理的情況下腫瘤球形成的數(shù)量在各組間仍有統(tǒng)計學(xué)差異，提示原代腫瘤球經(jīng)藥物處理后腫瘤細(xì)胞內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞含量顯著減少。流式細(xì)胞術(shù)檢測SP細(xì)胞時也發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷在較低濃度下即可減少H460細(xì)胞中的SP細(xì)胞含量。經(jīng)不同濃度萊菔硫烷（1.0、5.0和10μmol/L）處理的H460細(xì)胞中，經(jīng)蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)

22、肺癌細(xì)胞中多潛能維持因子的表達(dá)受到明顯抑制，呈現(xiàn)劑量依賴性，這提示肺癌干細(xì)胞自我更新的活性明顯降低。
　　 3.成功構(gòu)建Nanog啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒(Nanog-luc)并建立穩(wěn)定表達(dá)Nanog-luc的H460Nanog-luc細(xì)胞株;成功應(yīng)用此細(xì)胞株建立肺癌移植瘤動物模型。在此模型中萊菔硫烷有效抑制肺癌細(xì)胞H460中熒光素酶活性(F=242.06,P=0.000)，處理組比對照組降低至少76.81％。
　　 4.

23、萊菔硫烷處理H460后，β-catenin蛋白的表達(dá)受到抑制，呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性;成功構(gòu)建過表達(dá)活化的β-catenin細(xì)胞株H460-S33Y并且證實(shí)在此細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平顯著高于親本細(xì)胞;萊菔硫烷處理H460-S33Y細(xì)胞后Nanog和c-Myc蛋白表達(dá)受到抑制，這提示萊菔硫烷可通過Wnt/β-catenin通路以外的其他途徑調(diào)控肺癌干細(xì)胞自我更新。
　　 5.萊菔硫烷處理H460細(xì)胞后觀測腫瘤干細(xì)胞相

24、關(guān)的miRNA變化時，發(fā)現(xiàn)miR-214的轉(zhuǎn)錄水平升高至少8.8倍;抑制miR-214可促進(jìn)c-Myc和Sox2的表達(dá)，而萊菔硫烷與miR-214共同處理腫瘤細(xì)胞時c-Myc和Sox2蛋白的表達(dá)下調(diào)。RNA22程序分析結(jié)果表明，miR-214可直接作用于c-Myc mRNA中的編碼區(qū)序列。啟動子序列分析表明，Sox2啟動子序列中存在5個c-Myc結(jié)合位點(diǎn)。
　　 6.成功將c-Myc編碼區(qū)片段插入psiCHECK-2并構(gòu)建了c-

25、Myc編碼區(qū)片段調(diào)控的雙熒光素酶報告基因載體。雙熒光素酶報告載體檢測結(jié)果表明，miR-214可通過結(jié)合c-Myc編碼區(qū)片段，影響海腎熒光素酶的活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.萊菔硫烷能在體內(nèi)和體外條件下有效抑制肺癌細(xì)胞中的分化細(xì)胞并特異地靶向抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新，抑制多潛能因子的表達(dá)。
　　 2.除了Wnt/β-catenin通路外，萊菔硫烷還可通過其他調(diào)控途徑抑制肺癌干細(xì)胞自我更新。
　　 3.首次