萊菔硫烷對阿爾茨海默病模型小鼠神經行為的影響及其作用機制研究.pdf

1、前言
　　隨著世界人口老齡化的到來，老年癡呆患者數量持續(xù)上升，對人類健康的危害日益突出。阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是老年癡呆的主要類型之一，早期可導致病患智力低下、記憶喪失，晚期嚴重者可完全喪失生活自理能力，給家庭和社會增加了沉重的心理和經濟負擔，成為一個嚴重的社會問題。面對目前嚴峻的AD發(fā)病形勢，深入探討AD的發(fā)病機制，尋找有效的早期防治措施，已成為全世界學者的研究熱點。
　　AD的主要病理

2、表現為大腦皮質彌漫性萎縮，溝回增寬，腦室擴大，并可見到β淀粉樣蛋白（β-amyloidprotein，Aβ）沉積形成的老年斑(Senileplaques，SP)，膽堿能神經元的大量丟失，以及細胞內高度磷酸化Tau蛋白所致的神經元纖維纏結(Neurofibrillarytangles，NFT)。由于AD發(fā)病機制復雜，目前存在多種假說解釋其成因，其中Aβ級聯假說在眾多假說中占主導地位。研究發(fā)現，Aβ的過度產生和聚集對神經元具有毒性作用，可觸

3、發(fā)大腦神經元功能失常、死亡，且與G蛋白介導的信號轉導異常密切相關。G蛋白由α、β、γ三種亞基構成，其中α亞基變異最大，決定G蛋白的特異性。在AD患者腦內，Gq/11α介導的磷酸肌醇水解途徑受累最為嚴重。長久以來，Gβγ被認為是無功能性亞基，但近年研究發(fā)現，Gβγ也在多方面發(fā)揮著重要作用，其中Gβ亞基通常在Gβγ復合物中起到特異性效應調控的決定性作用。Gβ2作為Gβ亞基的一種，廣泛分布于腦內，且可能與一些神經退行性疾病的發(fā)生密切相關。大量

4、研究證實，Gq/11α被活化后，可通過增加磷脂酶C活性，產生細胞內信使三磷酸肌醇，進而促進細胞內儲存的鈣釋放。此外，有研究發(fā)現，Gβ亞基可以抑制電壓依賴性N和P/Q型鈣通道開放，進而降低細胞內游離Ca2+濃度，維持細胞內的鈣穩(wěn)態(tài)。同時，細胞內游離Ca2+水平的升高可造成Aβ生成增多，且加速Aβ聚集。因此，調控G蛋白表達，防止細胞內Ca2+紊亂，對減少AD腦內Aβ的產生和沉積，有效延緩AD發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
　　目前，植物化學物

5、因其為天然成分，對人體毒副作用較少并易于提取等優(yōu)點日益受到人們關注。植物化學物萊菔硫烷（Sulforaphane，SFN）是廣泛存在于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸鹽，在皮質損傷大鼠和中樞神經系統(tǒng)缺血性損傷模型中發(fā)現SFN具有較好的神經保護作用。近年來研究還發(fā)現，SFN可明顯減輕腦內單次注射Aβ誘導的急性AD模型小鼠認知功能障礙，然而其體外實驗結果顯示SFN對Aβ聚集并沒有抑制作用。關于SFN對AD患者/模型動物神經行為的影響及其作用機制

6、尚有待證實和探討。因此，本研究應用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)與鋁聯合染毒誘導的AD模型小鼠，采用Morris水迷宮和曠場實驗探討SFN對AD模型小鼠神經行為的影響，并通過觀察腦內SP沉積情況、G蛋白水平以及細胞內游離Ca2+水平的變化揭示其作用機制。
　　材料與方法
　　一、動物分組、處理及樣品采集
　　將初成年雄性小鼠按體重隨機分為對照組、模型組及干預組，每組10只。給藥途徑及劑量如下:模型組和

7、干預組小鼠飲用含鋁水(0.4g/100ml)并隔日皮下注射200mg/kgD-半乳糖，此外，干預組小鼠每日一次灌胃給予25mg/kgSFN，模型組小鼠每日一次灌胃等量蒸餾水，同時設立溶媒對照組。連續(xù)處理90d，實驗期間小鼠自由攝食及飲水。各組小鼠經神經行為學測試后，乙醚麻醉，脫頸椎法處死，冰上迅速剝離腦組織。將每組10只小鼠左側大腦皮質用于細胞內游離Ca2+和G蛋白mRNA水平的測定，右側腦組織以多聚甲醛固定，用于SP沉積情況的檢測。<

8、br>　　二、檢測指標及方法
　?。ㄒ唬┮话銧顩r及體重
　　每日觀察各組小鼠的自主活動、反應性、毛須光澤及死亡情況等，并每周稱重一次觀察小鼠體重變化。
　　（二）神經行為學
　　采用Morris水迷宮判斷小鼠學習記憶和空間定向及認知功能;以曠場試驗觀察小鼠適應新環(huán)境的空間認知與自主探索能力以及精神緊張度
　?。ㄈ┠X組織SP沉積
　　采用剛果紅染色法檢測各組小鼠大腦皮質和海馬SP沉積情況。
　　

9、（四）大腦皮質Gq/11α、Gβ2mRNA水平
　　總RNA提取試劑盒提取大腦皮質總RNA，以β-actin作為內參基因，采用SYBRGreenⅠ嵌合染料法對目的基因進行Real-timeRT-PCR，分析Gq/11α、Gβ2mRNA的相對表達水平。
　　（五）大腦皮質細胞內游離Ca2+水平
　　新型熒光探針Fluo-3/AM負載小鼠大腦皮質細胞，采用流式細胞術檢測細胞的平均熒光強度，每份樣品測定2萬個細胞的平均熒光強

10、度值，分析細胞內游離Ca2+水平。
　　三、統(tǒng)計分析
　　實驗數據用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果以(X)±S表示。數據均滿足方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗，檢驗水準:α=0.05。
　　結果
　　一、一般狀況及體重
　　整個受試期間各組小鼠活動自如，狀態(tài)良好，未見異常表現及死亡。各組小鼠體重在受試期間均有所增加，統(tǒng)計分析結果表明，各組小鼠體重之間的差異均無統(tǒng)計學

11、意義(P＞0.05)。
　　二、神經行為學
　　水迷宮實驗結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺所在位置的次數減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組小鼠比較，干預組小鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺所在位置的次數增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　曠場實驗結果顯示，與對照組小鼠比較，模型組小鼠跨格和直立次數減少，中央格停留時間延長，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組小鼠比

12、較，干預組小鼠跨格和直立次數增加，中央格停留時間減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　三、腦組織SP沉積
　　與對照組比較，模型組小鼠大腦皮質及海馬SP沉積數量均增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。干預組小鼠大腦皮質及海馬SP沉積數量均少于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　四、大腦皮質Gq/11α、Gβ2mRNA水平
　　與對照組比較，模型組小鼠大腦皮質Gβ2mRNA水平降低，差異有統(tǒng)

13、計學意義(P＜0.05)。干預組小鼠大腦皮質Gβ2mRNA水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組小鼠大腦皮質Gq/11αmRNA水平之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　五、大腦皮質細胞內游離Ca2+水平
　　與對照組相比，模型組小鼠大腦皮質細胞內游離Ca2+水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，干預組小鼠大腦皮質細胞內游離Ca2+水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。