鋅對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ沉積的影響及其機(jī)制.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）是發(fā)生在老年人群的一種以進(jìn)行性癡呆和情感障礙為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。AD最主要的病理學(xué)特征是細(xì)胞外出現(xiàn)大量的以β-淀粉樣蛋白（amyloid-βprotein，Aβ）為主要組成成分的老年斑。Aβ是由淀粉樣肽前體蛋白（amyloid-βprecursorprotein，APP）經(jīng)分泌酶剪切產(chǎn)生。APP的外功能區(qū)首先由β-分泌酶剪切并產(chǎn)生一個APPC-端片段，此片段進(jìn)一步由γ-分

2、泌酶復(fù)合體在其跨膜區(qū)域進(jìn)行剪切，進(jìn)而形成Aβ多肽。APP以及它的蛋白水解產(chǎn)物Aβ都是金屬蛋白，分子上有鋅結(jié)合位點，鋅離子與這些蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)在AD患者的大腦以及轉(zhuǎn)基因小鼠大腦Aβ老年斑內(nèi)有大量鋅離子沉積，鋅離子通過調(diào)節(jié)mRNA的5'-UTR來促進(jìn)APP的表達(dá)，更重要的是體外實驗證明鋅離子通過共價鍵與相鄰兩條Aβ分子第13位上的組氨酸結(jié)合，從而使Aβ聚合并形成纖維狀沉積。此外，鋅螯合劑CQ、DP-109等都可以降

3、低腦內(nèi)鋅含量，改善AD病人的認(rèn)知功能狀態(tài)，抑制AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)老年斑的形成。綜上可見，AD腦中鋅含量的異?？赡苁菍?dǎo)致Aβ積聚的一個重要因素，改善鋅代謝紊亂可能是治療AD的一個潛在策略。在動物在體水平，鋅離子對AD發(fā)病的病理過程及老年斑形成的影響機(jī)制目前尚無詳細(xì)報道。因此，本研究以AD模型小鼠-APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠做為實驗對象，分別用鋅離子和鋅螯合劑氯碘羥喹（clioquinol，CQ）處理動物，結(jié)合行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等手

4、段，檢測鋅離子對APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、腦內(nèi)老年斑形成、APP蛋白及其酶切產(chǎn)物以及Aβ分泌的影響，揭示鋅離子參與AD病理生理過程的分子機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 42只3月齡健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)均分為3組：（1）正常對照組；（2）溶劑對照組：腹腔注射等量二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）；（3）CQ組：腹腔注射CQ（Sigma，100mg/kg，用DMSO溶解為1％的儲

5、存液）。斷頭取腦，做TSQ熒光探針染色和金屬自顯影技術(shù)（AMG）組織化學(xué)染色。
　　 48只3月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠隨機(jī)均分為4組：（1）正常對照組；（2）高鋅組（喂飼含ZnSO4的水，濃度20mg/ml）；（3）鋅+CQ組（喂飼含ZnSO4的水，濃度20mg/ml，至7月齡時管飼法給予20mg/kg的CQ）；（4）CQ組（7月齡時管飼法給予20mg/kg的CQ）。每天記錄一次體重變化。當(dāng)小鼠到9月齡時，做Morris水

6、迷宮實驗，檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。隨后心臟取血并分離血清，進(jìn)行原子吸收光譜檢測，分析各組小鼠血清鋅的變化。斷頭取腦，大腦左半球固定做冰凍切片，右半球分離皮層和海馬，做分子生物學(xué)檢測。應(yīng)用AMG和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各組小鼠腦內(nèi)Aβ老年斑的變化；應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測各組小鼠大腦皮層APP、ADAM10、BACE1、PS1、sAPPα、sAPPβ蛋白表達(dá)的變化；應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測Aβ在各組小鼠大腦皮層的含量。
　

7、　 實驗結(jié)果：
　　 1.CQ對鋅離子螫合作用的檢測
　　 腹腔注射CQ組小鼠大腦鋅離子的TSQ熒光探針染色和AMG組織化學(xué)染色均明顯低于正常對照組和溶劑對照組，而溶劑對照組和正常對照組之間沒有明顯差異。
　　 2.鋅離子致轉(zhuǎn)基因鼠體重及血清鋅、腦鋅含量的變化
　　 與對照組相比，給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠的體重顯著下降，毛色變棕黃，血清鋅、腦鋅含量顯著增高。鋅螯合劑CQ能逆轉(zhuǎn)鋅對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的毒性作用，

8、但是其自身對轉(zhuǎn)基因鼠的膚色和體重沒有影響。
　　 3.鋅離子對轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　 與對照組相比，給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力均顯著降低，而鋅螯合劑CQ能一定程度改善高鋅喂養(yǎng)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并且其本身也能顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知能力。
　　 4.鋅離子對轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑形成的影響
　　 與對照組相比，給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠的大腦皮層、海馬的老年斑

9、塊明顯增多。鋅螯合劑CQ能減緩鋅對老年斑形成的促進(jìn)作用，CQ本身亦能顯著降低轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量。
　　 5.鋅離子對轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP蛋白及其分解酶、分解產(chǎn)物表達(dá)的影響
　　 與對照組相比，給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表達(dá)明顯增多，Aβ含量明顯增加，ADAM10和sAPPα表達(dá)下降；CQ組轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表達(dá)和可溶性Aβ含量減少，ADAM10和s