淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦鐵超載的干預(yù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是臨床上常見的一種老年性癡呆綜合癥，病理特征主要包括神經(jīng)元間β淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉積形成老年斑、過磷酸化tau蛋白為核心形成神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)、特定腦區(qū)選擇性神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)細(xì)胞過度炎癥反應(yīng)。隨著世界人口老齡化程度的不斷升高，AD的發(fā)病率也將不斷上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止2005年全球有2430

2、萬人患癡呆，每年新增癡呆病例460萬。我國(guó)的癡呆人數(shù)已近800萬，其中AD近600萬。這將對(duì)家庭以致社會(huì)造成越來越沉重的負(fù)擔(dān)，因此，對(duì)AD的致病機(jī)理及預(yù)防治療策略的研究顯得尤其迫切。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)AD患者的腦鐵水平異常升高，這可能與某些腦組織鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)失控有關(guān)。異常增高的腦鐵啟動(dòng)機(jī)體級(jí)聯(lián)放大機(jī)制，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，降低增高的腦鐵是防治AD的一個(gè)有效方法。臨床研究發(fā)現(xiàn)肌肉注射去

3、鐵胺（desferrioxamine，DFO）可改善患者的臨床癥狀及生活自理能力，但因其毒副作用強(qiáng)、口服效果差等缺點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用。從中藥提取的有效成分具有多重功效，可以抑制AD腦鐵超載，緩解腦鐵超載帶來中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退，這為提高AD患者的生活質(zhì)量，以及實(shí)現(xiàn)健康老齡化均具有重要的科學(xué)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。因此，本課題從中藥有效成分復(fù)方對(duì)AD神經(jīng)元腦鐵超載的干預(yù)效應(yīng)和作用環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，揭示中藥防治AD的可能機(jī)制，為臨床防冶AD提供科學(xué)依

4、據(jù)。
　　第一部分淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　目的:觀察淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)APPswe/PS1dE9(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　方法:9月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基小鼠108只，隨機(jī)分為模型組、淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組，9月齡雄性C57BL/6J(C57)小鼠18只作為陰性對(duì)照組。淫羊藿組小鼠灌胃給予

5、淫羊藿苷，黃芪組小鼠灌胃給予黃芪甲苷，葛根組灌胃給予葛根素，復(fù)方組灌胃給予淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方，模型組和陰性對(duì)照組給予等量生理鹽水。灌胃結(jié)束后，采用Morris水迷宮檢測(cè)各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力情況。
　　結(jié)果:水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在測(cè)試的5天內(nèi)所有小鼠的逃避潛伏期都表現(xiàn)為縮短趨勢(shì)。AD模型組與C57組相比，AD模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），復(fù)方組和DFO組逃避潛伏期均值較各單方組及模型組明顯下降，與AD

6、模型組相比明顯縮短(P＜0.05），但未達(dá)到正常水平，復(fù)方組和DFO組相比無明顯差異（P＞0.05）。各組小鼠的平均游泳速度均無明顯差異（P＞0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，監(jiān)測(cè)撤去平臺(tái)后各組小鼠跨平臺(tái)次數(shù)和各組小鼠在原平臺(tái)象限的活動(dòng)時(shí)間以及搜索策略，與C57組小鼠相比，AD模型組小鼠在原平臺(tái)所處象限搜索時(shí)間明顯降低(P＜0.05)，搜索能力測(cè)試中跨過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)也顯著減少(P＜0.05），搜索策略評(píng)分明顯降低(P＜0.05)

7、，復(fù)方組小鼠和DFO組小鼠在原平臺(tái)所在象限搜索時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)及搜索策略評(píng)分均較模型組顯著升高和增加（P＜0.05），但未恢復(fù)至正常水平，復(fù)方組小鼠和DFO組小鼠相比無明顯差異。
　　結(jié)論:APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠能夠較好的模擬AD患者學(xué)習(xí)記憶能力降低的表現(xiàn)，提供有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方可以有效的改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　第二部分淫羊藿、黃芪、葛根有效成分

8、復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響
　　目的:觀察淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠大腦皮質(zhì)病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:9月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基小鼠36只，隨機(jī)分為模型組、淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組，9月齡雄性C57小鼠6只作為陰性對(duì)照組。淫羊藿組小鼠灌胃給予淫羊藿苷，黃芪組小鼠灌胃給予黃芪甲苷，葛根組灌胃給予葛根素，復(fù)方組灌胃給予淫羊藿、

9、黃芪、葛根有效成分復(fù)方，模型組和陰性對(duì)照組給予等量生理鹽水。用藥結(jié)束后，采用尼氏染色、Bielschowsky銀染及透射電鏡技術(shù)觀察各組小鼠大腦皮質(zhì)的病理學(xué)改變。
　　結(jié)果:尼氏染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊且密集，胞漿中尼氏體豐富，大腦皮質(zhì)尼氏小體呈深藍(lán)色，細(xì)胞核淡藍(lán)色;模型組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元水腫，細(xì)胞數(shù)量減少，排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，胞漿內(nèi)尼氏體減少，分界不清，染成淡藍(lán)色;淫羊藿組、黃芪組、葛根組小鼠較

10、模型組小鼠神經(jīng)元水腫有所減輕，細(xì)胞數(shù)量略有增加。復(fù)方組和DFO組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊且密集，胞漿中尼氏體豐富，水腫明顯改善，細(xì)胞數(shù)量增加明顯;
　　改良Bielschowsky銀染結(jié)果顯示，C57對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列整齊、密集，未見老年斑。模型組小鼠大腦皮質(zhì)可見大量的老年斑，淫羊藿組、黃芪組和葛根組仍可見一定數(shù)量的老年斑，復(fù)方組小鼠及DFO組小鼠大腦皮質(zhì)與模型組相比老年斑數(shù)量減少，說明淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方

11、可以減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠大腦皮質(zhì)老年斑的沉積，且其效果較單方組更優(yōu)。
　　透射電鏡結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰;細(xì)胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)分布均勻，核仁大小正常;細(xì)胞膜及核膜完整;各細(xì)胞器形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列呈板層狀，多聚核糖體豐富，高爾基體形態(tài)正常，線粒體呈橢圓形，脊完整。模型組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)嚴(yán)重的變性和壞死，廣泛水腫、膜結(jié)構(gòu)通透性增高，失去正常形態(tài)，大量神經(jīng)元體積變小

12、，形態(tài)不規(guī)則。細(xì)胞核形態(tài)改變，分葉，核膜凹陷形成核裂，染色質(zhì)濃縮邊集，部分細(xì)胞核固縮，碎裂，溶解，核仁消失;細(xì)胞器腫脹崩解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，多聚核糖體解聚，游離核糖體增多，高爾基體囊泡擴(kuò)張，線粒體腫脹畸形，線粒體脊溶解斷裂;大量神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)消失，胞漿內(nèi)大量脂褐素。淫羊藿組、黃芪組和葛根組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)較為相似，部分神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)水腫，失去正常形態(tài)。部分細(xì)胞核形態(tài)改變，分葉，核膜凹陷形成核裂，染色質(zhì)濃縮

13、邊集，部分細(xì)胞核固縮，碎裂，溶解，核仁消失;可見少量神經(jīng)元細(xì)胞器腫脹崩解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，多聚核糖體解聚，游離核糖體增多，高爾基體囊泡擴(kuò)張，線粒體腫脹畸形，線粒體脊溶解斷裂;部分神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)消失;胞漿內(nèi)可見脂褐素。復(fù)方組和DFO組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)較為相似，神經(jīng)元形態(tài)接近正常對(duì)照組小鼠，形態(tài)較為規(guī)則。細(xì)胞核形態(tài)完整，膜結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布較為均勻，細(xì)胞器形態(tài)較為完整，結(jié)構(gòu)較為正常，多聚核糖體較為豐富，有少量的游離

14、核糖體，胞漿內(nèi)可見少量脂褐素。
　　結(jié)論:淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方能減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠大腦皮質(zhì)老年斑的沉積，降低神經(jīng)元的損傷。
　　第三部分淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦鐵含量的影響
　　目的:淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦鐵含量的影響研究
　　方法:9月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基小鼠36只，隨機(jī)分為模型組、淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和

15、DFO組，6月齡雄性C57小鼠6只作為陰性對(duì)照組。淫羊藿組小鼠灌胃給予淫羊藿苷，黃芪組小鼠灌胃給予黃芪甲苷，葛根組灌胃給予葛根素，復(fù)方組灌胃給予淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方，模型組和陰性對(duì)照組給予等量生理鹽水。用藥結(jié)束后，采用腦組織鐵化學(xué)染色法和石墨爐原子吸收光譜技術(shù)檢測(cè)各組小鼠大腦皮質(zhì)鐵含量。
　　結(jié)果:組織鐵化學(xué)染色結(jié)果顯示，各組小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見藍(lán)色鐵顆粒沉積，統(tǒng)計(jì)藍(lán)色鐵顆粒個(gè)數(shù)發(fā)現(xiàn):AD模型組與C57組相比，A

16、D模型組藍(lán)色鐵顆粒沉積明顯增多（P＜0.05），結(jié)果提示APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)大腦皮質(zhì)內(nèi)存在鐵超載。與AD模型組相比，淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組鐵顆粒沉積明顯減少(P＜0.05），復(fù)方組和DFO組與各單方組各組小鼠相比，鐵顆粒沉積明顯減少(P＜0.05)，復(fù)方組和DFO組相比無明顯差異（P＞0.05）
　　石墨爐原子吸收光譜檢測(cè)小鼠腦鐵含量結(jié)果顯示:與C57組小鼠相比，AD模型組小鼠腦鐵含量明顯升高（P＜0.

17、05），結(jié)果提示APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)大腦皮質(zhì)內(nèi)存在鐵超載。與AD模型組相比，黃芪組、葛根組、復(fù)方組和DFO組腦鐵含量明顯降低(P＜0.05），復(fù)方組和DFO組與各單方組各組小鼠相比，腦鐵含量明顯降低(P＜0.05），復(fù)方組和DFO組相比無明顯差異（P＞0.05）
　　結(jié)論:AD模型組小鼠腦鐵含量明顯升高，應(yīng)用淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方可以有效的降低腦鐵含量。
　　第四部分淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默

18、病轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)DMT1、FPN1表達(dá)的影響
　　目的:觀察淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)DMT1、FPN1表達(dá)的影響，探討淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方干預(yù)阿爾茨海默病小鼠腦鐵超載的作用機(jī)制。
　　方法:9月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基小鼠36只，隨機(jī)分為6組，模型組、淫羊藿組、黃芪組、葛根組、復(fù)方組、DFO組，9月齡雄性C57小鼠6只作為正常對(duì)照組。淫羊藿組小鼠灌胃給予淫羊藿苷水溶液

19、，黃芪組灌胃給予黃芪甲苷水溶液，葛根組灌胃給予葛根素水溶液，復(fù)方組灌胃給予淫羊藿、黃芪、葛根有效成分復(fù)方，DFO組肌肉注射DFO，模型組和陰性對(duì)照組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。灌胃結(jié)束后，取各組小鼠腦組織，分別采用免疫組化，Real time PCR和Western方法檢測(cè)各組小鼠大腦皮質(zhì)DMT1和FPN1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組均未見DMT1及FPN1陽性細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，模型組DMT1的表達(dá)增高

20、，模型組FPN1的表達(dá)降低;與模型組相比，復(fù)方組和DFO組DMT1的表達(dá)降低，模型組和DFO組FPN1的表達(dá)增高;與DFO組相比，復(fù)方組DMT1和FPN1的表達(dá)無明顯差異。Real time PCR結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組DMT1mRNA的表達(dá)均增高，模型組FPN1 mRNA的表達(dá)降低;與模型組相比，復(fù)方組和DFO組DMT1 mRNA的表達(dá)均降低，模型組和DFO組FPN1mRNA的表達(dá)增高;與DFO組相比，復(fù)方組DMT1和FP

21、N1 mRNA的表達(dá)無明顯差異。Western結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組DMT1-withIRE和DMT1-without IRE的表達(dá)均增高，模型組FPN1的表達(dá)降低;與模型組相比，復(fù)方組和DFO組DMT1-with IRE和DMT1-without IRE的表達(dá)均降低，模型組和DFO組FPN1的表達(dá)增高;與DFO組相比，復(fù)方組DMT1-with IRE、DMT1-without IRE和FPN1的表達(dá)無明顯差異。