阿爾茨海默病5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠眼部病變研究.pdf

1、目的：
　　1.研究淀粉樣前體蛋白在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠眼球不同結(jié)構(gòu)的蛋白分布。比較淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β蛋白裂解酶、γ蛋白裂解酶在不同年齡組5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠眼球不同結(jié)構(gòu)中蛋白含量的變化。觀察視紫紅質(zhì)在年齡、基因等不同因素作用下在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜的變化。
　　2.探索淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β淀粉裂解酶、γ淀粉裂解酶和視紫紅質(zhì)在5x

2、FAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的分布。
　　3.研究總tau蛋白和磷酸化tau蛋白在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠眼球不同結(jié)構(gòu)的蛋白分布。檢測不同位點磷酸化tau蛋白在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠眼球的表達(dá)。比較總tau蛋白和磷酸化tau蛋白在不同年齡組5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠眼球蛋白表達(dá)的改變。
　　4.檢測GSK3β和P-GSK3β含量在不同年齡組5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小

3、鼠眼球蛋白表達(dá)的改變,探討GSK3β通路是否參與磷酸化tau蛋白在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠眼部病變的過程。
　　方法：
　　1.選取2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠,用WesternBlot觀察淀粉樣前體蛋白在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和大腦組織中的表達(dá)。再選取不同年齡組5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠(2月和9月齡)和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠(1周、1月、2月和9月齡),WesternBlot觀察淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β蛋白裂解

4、酶、γ蛋白裂解酶和視紫紅質(zhì)在小鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和大腦組織蛋白表達(dá)的改變。
　　2.選取9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠,用組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分層技術(shù)探測淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β蛋白裂解酶、γ蛋白裂解酶和視紫紅質(zhì)在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和早期內(nèi)涵體的分布。
　　3.選取2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠,用WesternBlot觀察總tau蛋白和磷酸化tau蛋白在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和大腦組織中的表達(dá)。再選取不

5、同年齡組5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠(2月和9月齡)和(B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠1周、1月、2月和9月齡),蛋白純化并降磷酸化處理后,WesternBlot觀察不同位點磷酸化tau蛋白在小鼠視網(wǎng)膜和大腦表達(dá)的異同,以及總tau蛋白和磷酸化tau蛋白在小鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和大腦組織上蛋白表達(dá)的改變。
　　4.選取不同年齡組(2月和9月齡)5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠,WesternBlot觀察GSK3β,P-GSK3β與磷酸化t

6、au蛋白在視網(wǎng)膜和大腦組織上蛋白表達(dá)變化的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.淀粉樣前體蛋白在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)上均有分布,但表達(dá)形式不同,其中表達(dá)于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)上的蛋白形態(tài)最接近于大腦。發(fā)育期(1周齡至1月齡),淀粉樣前體蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上逐漸增加,且蛋白形式趨于成熟。成年期(2月齡至9月齡),淀粉樣前體蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上均顯著升高

7、(p=0.02,p<0.01)。2月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜淀粉樣前體蛋白含量與B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠無明顯差異,但9月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜淀粉樣前體蛋白含量顯著高于B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠(p<0.01)。淀粉樣前體蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視神經(jīng)上均較低,在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠顯著升高(p<0.01)。視網(wǎng)膜淀粉樣前體蛋白含量變化與大腦表現(xiàn)一致。
　　2.發(fā)育期(1周齡

8、至1月齡),磷酸化淀粉樣前體蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上較低。成年期(2月齡至9月齡),磷酸化淀粉樣前體蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上均顯著升高(p=0.03,p<0.01)。且2月齡和9月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜磷酸化淀粉樣前體蛋白含量均顯著高于B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠(p<0.01,p<0.01)。磷酸化淀粉樣前體蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視神經(jīng)上均

9、較低,在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠顯著升高(p<0.01)。視網(wǎng)膜磷酸化淀粉樣前體蛋白含量變化與大腦表現(xiàn)一致。
　　3.發(fā)育期(1周齡至1月齡),視紫紅質(zhì)含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜顯著增加。成年期(2月齡至9月齡),視紫紅質(zhì)含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜有所下降,但在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜下降顯著(p=0.01)。2月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜視紫紅質(zhì)含量與B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠無明顯差異,但9月齡時,5xF

10、AD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜視紫紅質(zhì)含量顯著低于B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠(p=0.01)。
　　4.發(fā)育期(1周齡至1月齡),β蛋白裂解酶和γ淀粉裂解酶含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上顯著降低。成年期(2月齡至9月齡),β蛋白裂解酶和γ淀粉裂解酶含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上均顯著升高(p<0.01,p=0.01)。且2月齡和9月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜β蛋白裂解酶和γ淀粉裂解酶含量均顯著高于B6SJ

11、L非轉(zhuǎn)基因小鼠(p<0.01,p<0.01)。視網(wǎng)膜β蛋白裂解酶和γ淀粉裂解酶含量變化與大腦表現(xiàn)一致。
　　5.9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位顯示淀粉樣前體蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和早期內(nèi)涵體,磷酸化淀粉樣蛋白位于高爾基體,β蛋白裂解酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和早期內(nèi)涵體,γ蛋白裂解酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,而視紫紅質(zhì)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　6.總tau蛋白和磷酸化tau蛋白僅在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜和視神經(jīng)上有分布,與

12、大腦表現(xiàn)一致。在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上主要表現(xiàn)為tau蛋白Ser396磷酸化位點(PHF-1),與大腦表現(xiàn)一致。Ser202位點僅表現(xiàn)在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜且不確定,而Ser199/Thr205磷酸化位點在視網(wǎng)膜上則未檢測到陽性表現(xiàn)。
　　7.發(fā)育期(1周齡至1月齡),總tau蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上顯著增加。成年期(2月齡至9月齡),總tau蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小

13、鼠和5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上均顯著升高(p<0.01,p<0.01)。2月齡和9月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜總tau蛋白含量均顯著高于B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠(p<0.01,p<0.01)?？倀au蛋白含量在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視神經(jīng)上均較低,在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠顯著升高。視網(wǎng)膜總tau蛋白含量變化與大腦表現(xiàn)一致。
　　8.發(fā)育期(1周齡至1月齡),PHF-1含量和PHF-1與總tau

14、蛋白含量的比值在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上顯著較低。成年期(2月齡至9月齡),PHF-1含量和PHF-1與總tau蛋白含量的比值在B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜上呈增高趨勢,在轉(zhuǎn)基因5xFAD小鼠視網(wǎng)膜上呈顯著增高(p<0.01,p<0.01)。且2月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜PHF-1含量和PHF-1與總tau蛋白含量的比值與B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠無差異,但9月齡時,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜PHF-1含量和PHF-1與總ta

15、u蛋白含量的比值均顯著高于B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠(p<0.01,p<0.01)。視網(wǎng)膜PHF-1含量變化與大腦表現(xiàn)一致。
　　9.成年期(2月齡至9月齡),GSK3β含量在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜較同齡B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠顯著升高(p=0.02),而P-GSK3β含量在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜較同齡B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)相應(yīng)的顯著降低(p=0.01)。視

16、網(wǎng)膜GSK3β和P-GSK3β含量變化與大腦表現(xiàn)一致。
　　結(jié)論：
　　1.在發(fā)育和衰老過程中,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜和視神經(jīng)上淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β蛋白裂解酶、γ淀粉裂解酶、總tau蛋白和磷酸化tau蛋白PHF-1蛋白量的表達(dá)變化與大腦組織中的蛋白含量變化具有一致性。
　　2.淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β蛋白裂解酶和γ淀粉裂解酶蛋白水平在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因

17、小鼠視網(wǎng)膜和大腦組織中較同齡B6SJL非轉(zhuǎn)基因小鼠和2月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠均有顯著升高,而視紫紅質(zhì)蛋白水平則顯著降低。
　　3.淀粉樣前體蛋白、磷酸化淀粉樣前體蛋白、β蛋白裂解酶、γ淀粉裂解酶和視紫紅質(zhì)在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和早期內(nèi)涵體中,與大腦組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布具有一致性。
　　4.總tau蛋白量、PHF-1蛋白量、PHF-1與總tau蛋白比值在9月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因