CYR61、CTGF和WISP-1在肺癌組織中的表達(dá)及萊菔硫烷對(duì)CYR61的影響.pdf

1、肺癌已成為世界上主要的腫瘤死因之一。而且多數(shù)證據(jù)顯示：CCN蛋白參與腫瘤發(fā)生過程，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)CCN蛋白上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，提示CCN蛋白表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生起正向或負(fù)向的調(diào)節(jié)作用。人肺癌細(xì)胞株研究證實(shí)，CYR61和CTGF抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，并視為腫瘤抑制因子。CYR61是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制因子，通過上調(diào)p53觸發(fā)信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)。WISP-1和WISP-2在Wnt信號(hào)調(diào)節(jié)過程中起下調(diào)作用。萊菔硫烷(SFN)是

2、十字花科植物中含有的一種異硫氰酸鹽，在綠花椰菜中含量最多。SFN在腫瘤發(fā)生的多個(gè)階段發(fā)揮抑制作用，而且還是潛在的腫瘤治療藥物。SFN與腫瘤的關(guān)系研究正成為腫瘤學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。 本次實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(FQ-PCR)和免疫組化方法分析CYR61、CTGF和WISP-1三種基因在肺癌原發(fā)灶及匹配正常肺組織中的表達(dá)和臨床病理參數(shù)關(guān)系，通過MTT和FQ-PCR分析SFN干預(yù)對(duì)A549細(xì)胞株CYR61基因表達(dá)的影響，探

3、討SFN對(duì)A549細(xì)胞的作用。 實(shí)驗(yàn)方法1.對(duì)象選擇、組織樣本的采集與病人相關(guān)病例的整理 選取2002年至2005年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就醫(yī)的肺癌患者作為研究對(duì)象，采集手術(shù)后患者肺癌原發(fā)灶及其匹配的正常肺組織有效標(biāo)本60對(duì)。大多數(shù)標(biāo)本離體后不超過1h，均放在-70℃冰箱中冷凍保存。收集病人的性別、年齡、吸煙情況、結(jié)核病史、發(fā)病部位、病理類型、腫瘤大小、臨床分型等方面的臨床資料，便于統(tǒng)計(jì)分析和研究。 2.采用Tr

4、izol試劑提取人體肺癌患者組織標(biāo)本和A549細(xì)胞株RNA。通過1％的瓊脂糖凝膠電泳及RNA的OD值評(píng)估RNA含量和純度。 3.使用Promega公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR擴(kuò)增β-actin檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效果。 4.CYR61、CTGF和WISP-1三種基因在肺癌原發(fā)灶及匹配正常肺組織中表達(dá)量分析。FQ-PCR利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析；免疫

5、組化方法分析CYR61、CTGF和WISP-1三種基因編碼蛋白的表達(dá)情況。 5.用MTT法檢測(cè)SFN對(duì)A549細(xì)胞的抑制效應(yīng)，計(jì)算不同濃度SFN對(duì)A549細(xì)胞的50％抑制率。摸索SFN對(duì)A549細(xì)胞的有效干預(yù)時(shí)間點(diǎn)和有效作用濃度區(qū)間。然后用SFN對(duì)體外培養(yǎng)的A549肺癌細(xì)胞株進(jìn)行處理，最后用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)SFN對(duì)體外培養(yǎng)的A549肺癌細(xì)胞株CYR61表達(dá)的影響。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)每個(gè)樣本來(lái)說，用dCt(Ctβ-ac

6、tin-CtcYR61)值表示目的基因與內(nèi)參基因β-actin間Ct的差值，ddCt值等于dCt(experimentalsample)-dCt(calibratorvalue)。對(duì)ddCt采用正態(tài)性檢驗(yàn)。 對(duì)肺癌樣本每種基因的表達(dá)和家族史、轉(zhuǎn)移、吸煙、腫瘤分級(jí)、腫瘤病理、肺結(jié)核、性別、腫瘤位置、腫瘤大小和患者年齡等單個(gè)臨床參數(shù)間的關(guān)系采用t-檢驗(yàn)和方差分析。采用Pearson相關(guān)分析，通過量化三種基因的表達(dá)結(jié)果估計(jì)相關(guān)程度，按

7、0.05水準(zhǔn)雙側(cè)概率確定結(jié)果有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多元線性回歸分析，分析基因表達(dá)的影響因素。 采用Mias2000圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。用卡方檢驗(yàn)分析肺癌患者原發(fā)灶及其配對(duì)正常肺組織的表達(dá)陽(yáng)性率的差異。 采用單因素方差分析，分析SFN干預(yù)前后A549肺癌細(xì)胞株CYR61基因表達(dá)量的差異。 結(jié)果1.FQ-PCR結(jié)果顯示：80％(48/60)的肺癌原發(fā)灶標(biāo)本CYR61基因的表達(dá)低于其匹配的正常肺組織

8、標(biāo)本；65％(39/60)的原發(fā)灶標(biāo)本CTGF基因的表達(dá)低于其匹配的正常肺組織標(biāo)本；83％(50/60)的原發(fā)灶標(biāo)本W(wǎng)ISP-1基因的表達(dá)高于其匹配的正常肺組織標(biāo)本。 2.CYR61多元線性回歸分析顯示：CYR61基因表達(dá)主要受AC，SC和年齡的影響，其次受CTGF基因表達(dá)、吸煙、有無(wú)轉(zhuǎn)移的影響，最后是左上位和家族史的影響。年齡和左上位起負(fù)調(diào)節(jié)作用，AC、SC、CTGF、吸煙、轉(zhuǎn)移和家族史是正調(diào)節(jié)因子，這些自變量的聯(lián)合作用促使肺

9、癌組織CYR61基因的表達(dá)低于配對(duì)的正常肺組織。 3.CTGF多元線性回歸分析顯示：右上位、CYR61的表達(dá)水平、左上位、左下位、性別、吸煙、SC以及WISP-1的表達(dá)水平以逐步遞減的方式影響CTGF基因的表達(dá)，CYR61基因的表達(dá)水平、性別、吸煙和SC是危險(xiǎn)因素，WISP-1基因的表達(dá)水平、左上位、左下位、右上位是保護(hù)因素。 4.WISP-1多元線性回歸分析顯示：WISP-1基因表達(dá)主要受ASC的影響，其次受年齡和家族

10、史的影響，很少受轉(zhuǎn)移、腺癌、性別、CTGF基因表達(dá)量的影響，危險(xiǎn)因素來(lái)自腺鱗癌、家族史和腺癌，保護(hù)因素有年齡、轉(zhuǎn)移、性別及CTGF基因表達(dá)水平。 5.MTT結(jié)果顯示：SFN從40μM的濃度起開始出現(xiàn)細(xì)胞抑制效應(yīng)，隨著濃度的升高呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，濃度越高抑制率越大；且40μM、80μM、100μM和160μMSFN等較大劑量不同濃度干預(yù)組在8h、16h、24h和32h等不同作用時(shí)間點(diǎn)具有時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越大。

11、 6.光鏡下細(xì)胞形態(tài)：A549細(xì)胞培養(yǎng)32h后，溶劑對(duì)照、陰性對(duì)照及12.5μM的SFN處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化不明顯；25μM的SFN處理組部分細(xì)胞皺縮、變圓，折光性上升；50μM的SFN處理組皺縮細(xì)胞數(shù)目增多；75μM的SFN處理組細(xì)胞皺縮數(shù)目增多，部分細(xì)胞漂浮，并可見細(xì)胞碎片。 7.25μM和50μM濃度SFN干預(yù)組的CYR61基因表達(dá)量較高，按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)雙側(cè)概率，25μMSFN組與50μMSFN組之間差異沒有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義，25μMSFN組和50μMSFN組與其它各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。75μM濃度SFN干預(yù)組的CYR61基因表達(dá)低于50μM濃度SFN干預(yù)組。 結(jié)論1.本研究通過對(duì)肺癌患者原發(fā)灶標(biāo)本及其匹配的肺正常組織標(biāo)本基因表達(dá)分析認(rèn)為，CYR61和CTGF抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，為抑癌基因，WISP-1為癌基因。2.CYR61、CTGF和WISP-1基因的表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)。CYR61基因的表達(dá)主要受AC、SC和年齡的影響，