一新的人結外鼻型NK-T細胞淋巴瘤裸鼠模型鑒定與CYR61基因在該腫瘤中的表達及意義.pdf

1、結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤(Extranodal nasal type NK／T celllymphoma)是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學行為的腫瘤，多原發(fā)于淋巴結外器官或組織，存在高水平EB病毒感染。人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤在亞洲地區(qū)，而在西方發(fā)達國家和地區(qū)則罕見。在中國，該腫瘤約占所有非霍奇金淋巴瘤的15％，可以說該腫瘤是我國的“特產”之一。 由于該腫瘤的病變部位的特殊，主要是在中線面部，如鼻腔和咽部等處，且活檢組

2、織多較小，在完成外科病理診斷后所剩無幾。由于研究材料的限制，嚴重制約了對這一特殊類型腫瘤的深入研究。因此，人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤裸鼠模型的建立不僅可以解決該腫瘤研究材料匱乏的問題，同時由于模擬了該腫瘤在人體內生長情況，對該腫瘤發(fā)病的分子機制、腫瘤的演進、治療及藥物篩選的進一步深入研究有重要的實用價值。到目前為止，國外僅有少數幾個鼻型NK／T細胞淋巴瘤細胞系的報道。在國內外尚未見到有關人類結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤腫瘤組織塊直接埋入

3、裸鼠皮下而建成該腫瘤動物模型的報道。 近年來，科學家們發(fā)現了一個新的基因家族，該家族成員蛋白質結構高度保守而生物學功能各不相同。由于CYR61、CTGF和nov是這個家族最初的成員，因此，我們仍然稱這個家族為CCN家族。CYR61 (cysteine-rich 6l， angiogerlic indLicer，61或 cysteine-rich heparin-binding protein 61)，屬于早期即刻基因，

4、是CCN家族中第一個被克隆的基因，位于lp22.3，全長2931bp，含有5個外顯子。CYR61蛋白由381個氨基酸殘基構成，含有四個結構模塊，分別是胰島素樣生長因子結合區(qū)域、von Willebrand型結構域、血小板反應I型蛋白和C-未端模塊。CYR61是一重要的信號傳導因子，具有與肝素及胰島素樣生長因子選擇性結合的功能，并參與了細胞粘附、細胞增殖、趨化、形態(tài)形成、細胞生長調節(jié)、血管形成及刺激反應等生理過程，在多種疾病及腫瘤中異常表

5、達。目前發(fā)現CYR61可能通過以下幾條信號通路在腫瘤生長及其血管形成中發(fā)揮重要作用： (1)CYR61上調整合素家族(如α v β3、 α6 β l、 α v β 5和α Ⅱ β 3)蛋白的表達一活化ILK(integrin-linked kinase)→刺激β-catenin的活性和上調cyclinD1→促進細胞增殖；2 CYR61上調整合素家族(如αβ 3和αβ 5)蛋白的表達一刺激NF-κB的活性→XIAP→抑制凋亡；3 VE

6、GF→上調CYR61→血管形成及微血管密度增加。 本研究嘗試建立人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤的裸鼠模型，并對該模型進行一系列鑒定以確立動物模型成功建立。同時還用實時熒光定量PCR及免疫組織化學技術對供體人鼻型NK／T細胞淋巴瘤的原發(fā)瘤及繼發(fā)瘤、裸鼠移植瘤和一組鼻型NK／T細胞淋巴瘤病例進行了CYR6l基因及相關基因的轉錄和蛋白水平的檢測。旨在建立穩(wěn)定的人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤裸鼠模型，了解CYR6l基因及相關基因在人結外鼻型

7、NK／T細胞淋巴瘤腫瘤組織中的表達，并探討CYR6l基因及相關基因轉錄與蛋白水平表達的相關性、CYR61基因及相關基因轉錄與蛋白水平表達的變化與該腫瘤生物學行為的關系以及CYR6l基因及相關基因的轉錄與蛋白水平表達的變化與人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤預后的關系。 主要研究結果如下： 1．人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤裸鼠模型的建立與鑒定選擇人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤胃繼發(fā)瘤的腫瘤組織，通過裸鼠移植并傳代，經過近三年的嘗試

8、，移植瘤現已傳至第三十代，初步建成該腫瘤的裸鼠模型。該移植瘤從病理形態(tài)、免疫表型、EBV感染以及分子生物學特征等方面均與人鼻腔原發(fā)瘤和胃轉移瘤基本一致。移植瘤中存在人類特異性序列標簽位點SY14，經熒光原位雜交(FISH)技術檢測發(fā)現裸鼠移植瘤腫瘤細胞中含有人類Y染色體，同時裸鼠移植瘤表達人類白細胞分化抗原HLA-ABC。 2．CYR61基因及相關基因轉錄與蛋白水平表達的檢測用實時熒光定量PCR及免疫組織化學技術對供體人結外鼻型

9、NK／T細胞淋巴瘤的原發(fā)瘤及繼發(fā)瘤、裸鼠移植瘤以及20例人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤病例進行了CYR61 mRNA及VEGF mRNA水平的檢測，并對40例該類腫瘤病例進行了CYR61蛋白及相關細胞因子表達的檢測。結果示人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤中CYR6l mRNA、VEGFmRNA、CYR6l蛋白、VEGF蛋白、NFkBP65表達均明顯上調，其瘤細胞均不表達β-CATENIN蛋白，P21蛋白陽性率為48.7％。結外鼻型NK／T細胞

10、淋巴瘤病例MVD明顯高于淋巴結反應性增生病例(F=5.672，P=0.022)。 3．CYR61基因及相關基因表達的相關性分析 (1)VEGF mRNA與CYR61 mRNA相互關系的密切程度分析結果發(fā)現：相關系數r=0.499，P=0.025，差異具有顯著性，VEGF mRNA與CYR61mRNA的表達情況具有較強的相關性； (2)VEGF和NFkBP65及CYR61蛋白表達一致性較高，與CYR61表達之間相關性強，而P

11、21與CYR61蛋白表達一致性差，與CYR61表達之間相關性弱。 4。CYR6l基因及相關基因與人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤生物學行為的關系 (1)CYR6l基因與血管浸潤的相關性分析：CYR61 mRNA及cYR6l蛋白表達均與血管浸潤有關，有血管浸潤者CYR6l mRNA及CYR6l蛋白表達水平高于無血管浸潤病例； (2)VEGF基因與血管浸潤的相關性分析：VEGF mRNA及VEGF蛋白表達均與血管浸潤有關，VEGF

12、mRNA及VEGF蛋白在血管浸潤者表達水平較高； (3)CYR6l及VEGF蛋白表達與結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤微血管密度有關，表達水平較高的病例其微血管密度也較大； (4)CYR61蛋白表達與Ki-67的相關性分析結果發(fā)現：CYR61與結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤細胞增殖有關，CYR61蛋白高水平表達病例的腫瘤細胞增殖指數高，細胞增殖活躍。 綜上所述，本研究直接將人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤的腫瘤組織塊移植于裸鼠，成功建立了

13、該腫瘤的裸鼠模型，該模型再現了人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤的重要生物學特征，是一較理想的人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤裸鼠模型。到目前為止，在國內外尚未見類似報道。人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤中CYR61和VEGF在轉錄及蛋白表達水平均明顯上調，可能是人結外鼻型NK／T細胞淋巴瘤的重要事件。VEGF→CYR6l→血管形成及微血管密度增加通路在該腫瘤中具有重要作用，也是CYR61在該腫瘤中發(fā)揮作用的主要機制；同時該腫瘤細胞NF K B P6