Cyr61在類風濕性關(guān)節(jié)炎炎癥微環(huán)境中的作用及其調(diào)控機制.pdf

1、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜組織過度增生，骨與軟骨破壞為主要特征的全身性慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機理目前還不清楚。Cyr61是一種細胞外基質(zhì)蛋白，廣泛參與調(diào)控細胞增殖、粘附、遷移、分化、損傷修復(fù)和胚胎發(fā)育等多種功能。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cyr61蛋白在類風濕性關(guān)節(jié)炎病人成纖維樣滑膜細胞(FLS)中高表達，具有促進滑膜細胞增殖及抑制其凋亡的作用。炎癥因子IL-17可通過NF-κB和AP1信號途徑上調(diào)FLS表達Cyr61。

2、這一研究結(jié)果首次證明Cyr61參與了RA滑膜組織的過度增生，并提示Cyr61與炎癥細胞(Th17)之間存在密切關(guān)系。Th17細胞通過分泌炎癥因子IL-17調(diào)控FLS表達Cyr61，那么，F(xiàn)LS能否反過來通過分泌Cyr61調(diào)控Th17細胞分化呢？其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控又是如何的呢？本研究目的是研究Cyr61在Th17細胞分化中的作用及其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。
　　首先，我們研究了Cyr61在Th17細胞分化中的作用。通過ELISA檢測，我們發(fā)現(xiàn)RA

3、病人滑液中IL-6的水平是升高的，而Cyr61蛋白可通過αvβ5-Akt-NF-κB信號通路途徑促進FLS產(chǎn)生IL-6。采用Transwell系統(tǒng)將FLS和CD4+T細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Cyr61刺激的FLS可促進CD4+T細胞往Th17細胞分化，而干擾內(nèi)源性Cyr61的FLS則失去這種促分化能力。在體內(nèi)，用特異性小鼠抗人Cyr61單克隆抗體093G9阻斷CIA小鼠體內(nèi)Cyr61蛋白作用，可明顯抑制Th17細胞分化和小鼠關(guān)節(jié)炎癥。表明Cyr

4、61可作為一種“前炎癥因子”促進Th17細胞分化，加劇RA關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)。
　　接下來，為進一步探索Cyr61上述病理性功能的作用表位，我們采用噬菌體庫篩選方法明確了093G9的結(jié)合表位為LPNLGCP，位于Cyr61蛋白的VWC結(jié)構(gòu)域140-146位氨基酸。這提示Cyr61的VWC結(jié)構(gòu)域可能是一個功能性結(jié)構(gòu)域，在RA滑膜增生和炎癥中起重要作用。
　　最后，我們對Cyr61的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進行了研究。由于目前關(guān)于Cyr61的轉(zhuǎn)

5、錄后調(diào)控報道還甚少。在RA中，還沒有關(guān)于Cyr61的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控報道。因此我們首先通過常用的軟件預(yù)測可能參與Cyr61調(diào)控的miRNA。經(jīng)過比對和篩選，我們選擇用TargetScan預(yù)測的miR-22進行實驗，發(fā)現(xiàn)miR-22的確可結(jié)合在Cyr613'UTR，抑制Cyr61轉(zhuǎn)錄后表達。進而，通過Taqman探針檢測，我們發(fā)現(xiàn)miR-22在RA滑膜組織中表達降低，從而使得Cyr61表達升高，進一步功能實驗證實了轉(zhuǎn)染miR-22后RAFLS中

6、的Cyr61表達降低，F(xiàn)LS的粘附，增殖和遷移都隨之降低。那么，RA中miR-22為何表達降低呢？通過構(gòu)建p53質(zhì)粒和miR-22啟動子區(qū)Luc報告基因質(zhì)粒，我們發(fā)現(xiàn)p53能夠結(jié)合在miR-22的啟動子上促進miR22表達。而在RA中，通過p53外顯子測序，我們發(fā)現(xiàn)p53是突變的，因而不能啟動miR-22表達，使得miR-22表達降低。這不僅闡明了Cyr61的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，也拓展了p53的生物學(xué)作用，提示p53不僅與細胞增殖相關(guān)，還能