Cyr61在增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體液中的表達及其對Muller細胞的作用.pdf

1、目的:檢測增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者玻璃體液中的富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich61，Cyr61)的含量，探討體外培養(yǎng)的人Müller細胞在高糖條件下能否表達Cyr61 mRNA和蛋白，及Cyr61對人Müller細胞遷移、凋亡等影響。
　　方法:使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELI

2、SA)檢測20名（20眼）PDR患者和12名（12眼）特發(fā)性黃斑裂孔和特發(fā)性黃斑前膜(idiopathic macular hole/idiopathic macular epiretinal membrane, IMH/IEM)患者玻璃體液Cyr61的含量。PDR患者20名作為實驗組，其中PDR無視網(wǎng)膜脫離者10名，PDR伴視網(wǎng)膜脫離者10名;特發(fā)性黃斑裂孔或特發(fā)性黃斑前膜患者12名作為對照組。在基因水平，通過RT-qPCR(real

3、 time-qPCR)技術，檢測人Müller細胞在高糖條件下（5、10、20 mM）是否表達Cyr61 mRNA，進而檢測人Müller細胞在不同時間(4、6、8、24 h) Cyr61 mRNA的表達。在蛋白水平，通過western blot技術，檢測人Müller細胞在高糖條件(5、10、20 mM)是否表達Cyr61蛋白。將濃度分別為0、10、30、100、300 ng/mL的Cyr61分別加入人Müller細胞中培養(yǎng)24 h和

4、48 h，通過MTT比色法檢測Cyr61對人Müller細胞存活率的影響。通過Transwell技術，觀察不同濃度Cyr61(0、3、10、30、100、300 ng/mL)對人Müller細胞遷移的影響。再通過TUNEL實驗，檢測不同濃度Cyr61（0、30、300 ng/mL）對人Müller細胞凋亡的影響。
　　結果:
　　1.ELISA結果顯示:PDR組玻璃體液Cyr61的含量(3576.92±1574.58pg/m

5、L)顯著高于對照組(436.14±130.69 pg/mL)，差異具有統(tǒng)計學意義(Mann-Whitney U test，P=0.002)。實驗組中，PDR不伴有視網(wǎng)膜脫離組玻璃體液Cyr61含量為4988.90±1058.80 pg/mL，比PDR伴有視網(wǎng)膜脫離組Cyr61含量(2341.43±509.44 pg/mL)高2倍多，兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義(Mann-Whitney U test,P=0.013)。
　　2.RT

6、-qPCR結果顯示:Cyr61 mRNA在10 mM糖濃度時開始增高，當糖濃度為20 mM時，Cyr61 mRNA表達最高，呈在劑量依賴模式，糖的劑量越高，其刺激人Müller細胞Cyr61 mRNA表達效果越明顯。進一步發(fā)現(xiàn)Cyr61 mRNA在高糖(10 mM)刺激人Müller細胞8h開始增高，在24h時Cyr6 mRNA表達最高，呈時間依賴模式，刺激時間越長，人Müller細胞表達Cyr61 mRNA效果越顯著。
　　3.

7、Western blot結果顯示:Cyr61蛋白在10 mM糖濃度時開始增高，20 mM時達到高峰，也呈在劑量依賴模式，糖的劑量越高，其刺激人Müller細胞表達Cyr61蛋白效果越明顯。
　　4.MTT結果顯示:人Müller細胞在不同濃度Cyr61(0、10、30、100、300ng/mL)培養(yǎng)24 h時，人Müller細胞存活率在Cyr61濃度為100 ng/mL時開始下降，隨著Cyr61濃度增大，Müller細胞存活率越低

8、。當在培養(yǎng)48 h時，人Müller細胞存活率在Cyr61濃度為10 ng/mL時開始下降，隨著Cyr61濃度增大，Müller細胞存活率越低。均呈劑量依賴模式。
　　5.Transwell結果顯示:不同Cyr61濃度(0、3、10、30、100、300 ng/mL)刺激人Müller細胞，Cyr61濃度為3 ng/mL Müler細胞遷移增加，當30 ng/mL對Müller細胞的遷移作用開始抑制。
　　6.不同濃度人Cy