富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)參與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究CYR61（cysteine-rich61；CCN1）對脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A細(xì)胞系）增殖、遷移及形成管狀結(jié)構(gòu)的影響。
　　 2.研究CYR61在糖尿病小鼠和正常小鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)和分布情況及其差異。
　　 3.研究增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR）患者玻璃體CYR61的表達(dá)水平，以及CYR61在視網(wǎng)膜增殖膜內(nèi)的表達(dá)和分布。
　　 方法：
　　 1.通過MTT比色實驗觀

2、察CYR61對RF/6A細(xì)胞增殖能力的影響；應(yīng)用Transwell小室觀察CYR61作用下，RF/6A細(xì)胞遷移能力的變化；采用Matrigel基質(zhì)膠，觀察CYR61對RF/6A細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的影響。
　　 2.腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制作糖尿病小鼠模型，通過免疫組織化學(xué)方法觀察CYR61在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)和分布，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法分析視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA的表達(dá)情況。
　　 3.

3、收集玻璃體切除手術(shù)患者的玻璃體液和視網(wǎng)膜前膜，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）方法測定PDR患者和非糖尿病患者玻璃體CYR61的濃度，利用免疫組織化學(xué)方法觀察CYR61在PDR、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）和特發(fā)性黃斑前膜患者的視網(wǎng)膜前膜中的表達(dá)和分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.用不同濃度的CYR61（0，5 ng/mL，10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL，500ng/mL）干預(yù)RF/6A細(xì)

4、胞72h，隨著CYR61濃度增加，MTT比色實驗的吸光度A490nm值升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.000）；400ng/mL Cry61干預(yù)RF/6A細(xì)胞不同時間（0，12h，24h，48h，72h），隨著時間延長，A490nm.值升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.000）。Transwell小室實驗中，隨著CYR61濃度增加，遷移的RF/6A細(xì)胞增加（p=0.000），400ng/ml CYR61促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力與80ng/m

5、l VEGF相當(dāng)，而加入抗CYR61抗體則可以起到顯著的抑制作用。Matrigel基質(zhì)膠實驗中，隨著CYR61濃度增加，RF/6A細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)增多（p=0.000），400ng/ml CYR61與80ng/ml VEGF的作用相當(dāng)，而加入抗CYR61抗體則可以起到顯著的抑制作用。
　　 2.在正常小鼠的視網(wǎng)膜，CYR61在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、外從狀層和光感受器層均有表達(dá)，其中外從狀層表達(dá)較強(qiáng)，其余各層弱陽性染色；在糖尿

6、病小鼠的視網(wǎng)膜，CYR61同樣在以上各層表達(dá)，但神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層的表達(dá)較正常小鼠明顯增強(qiáng)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊狀的陽性染色。糖尿病小鼠視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA的表達(dá)較正常對照組增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.009）。
　　 3.PDR組玻璃體CYR61濃度為97.53±34.13（41.21～154.74）ng/mL，對照組玻璃體CYR61濃度為33.92±18.68（6.24～70.04）ng/mL，兩組有顯著

7、性差異（p=0.000）；視網(wǎng)膜和增殖膜新生血管豐富者玻璃體CYR61明顯高于無明顯新生血管者（p=0.001）；未發(fā)現(xiàn)玻璃體CYR61與患者年齡、糖尿病病程及術(shù)前空腹血糖有關(guān)（p>0.05）。CYR61分布于視網(wǎng)膜前膜的細(xì)胞胞漿中，在PDR視網(wǎng)膜前增殖膜中管腔樣結(jié)構(gòu)的管壁細(xì)胞高度表達(dá)，在其它細(xì)胞也可見散在的陽性染色；PVR視網(wǎng)膜前增殖膜及特發(fā)性黃斑前膜中，有散在的陽性染色細(xì)胞。
　　 結(jié)論
　　 CYR61在體外可以促