血卟啉單甲醚聲動(dòng)力作用對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、本文就血卟啉單甲醚聲動(dòng)力作用對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)及其機(jī)制進(jìn)行了研究，主要從以下幾部分展開(kāi)： 第一部分血卟啉單甲醚聲動(dòng)力作用對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察血卟啉單甲醚聲動(dòng)力作用對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106的急性細(xì)胞毒作用。 方法：首先采用MTT法檢測(cè)不同超聲輻照時(shí)間(0s、10s、30s、60s、90s)及不同HMME濃度(0、10、20、40、50μg/ml)對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞

2、UMR-106存活率的影響，以確定最佳輻照時(shí)間和HMME濃度，聲動(dòng)力參數(shù)(超聲頻率10.50Mhz、聲強(qiáng)：0.5W/cm2)。將大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106懸液分為：對(duì)照組(C組)、單純血卟啉單甲醚組(HMME組)、單純超聲組(U組)和聲動(dòng)力組(SDT組)，以MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率，AnnexinV/PI雙染色經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其死亡方式，并以透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果：超聲輻照30s、60s及90s時(shí)，可明顯降

3、低大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106的存活率(P＜0.05)，輻照時(shí)間為10s時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P＞0.05)；單純HMME對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P＞0.05)。當(dāng)輻照時(shí)間為10s、HMME為20μg/ml和50μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.05)，AnnexinV/PI雙染色檢測(cè)及透射電鏡結(jié)果顯示UMR-106細(xì)胞存在壞死與凋亡，透射電鏡可見(jiàn)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106微絨毛減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，胞漿內(nèi)大小不一空

4、泡形成，線粒體髓樣變，核內(nèi)假性包含體，核周隙增大，胞膜破裂、胞質(zhì)流失，染色質(zhì)邊集，核碎裂、溶解等改變。 結(jié)論：HMME是一種有效的聲敏劑，其聲動(dòng)力效應(yīng)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106具有顯著殺傷作用，可望為骨肉瘤治療提供新的手段。 第二部分血卟啉單甲醚聲動(dòng)力作用對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106的抑制效應(yīng)及其機(jī)制研究 目的：從細(xì)胞增殖狀況觀察血卟啉單甲醚聲動(dòng)力效應(yīng)對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106的遲發(fā)抑制作用，并

5、初步探討其作用機(jī)制。 方法：將大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106懸液分為對(duì)照組(C組)、單純血卟啉單甲醚組(HMME組)、單純超聲組(U組)、聲動(dòng)力組(SDT組)。聲動(dòng)力參數(shù)(超聲頻率10.50MHz、聲強(qiáng)：0.5W/cm2、輻照時(shí)間：10秒)，HMME：20μg/ml，采用MTT法檢測(cè)12h、24h、36h、48h的大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106存活率。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，羅丹明123(Rhodamine 123)檢測(cè)線粒體膜電位(△ψ

6、m)；二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧，F(xiàn)luo-3-Am(乙酰甲酯衍生物)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。33258核染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)改變。 結(jié)果：MTT檢測(cè)法顯示SDT組細(xì)胞存活率分別為69.42％(12h)，50.10％(24h)，44.37％(36h)，and 43.26％(48h)，與U組、C組和HMME組間同一時(shí)間段比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P＜0.01)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，線粒體膜電位降低的細(xì)胞

7、百分比、細(xì)胞內(nèi)活性氧增高和細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高的細(xì)胞百分比，SDT組與C組，HMME組和U組相比，有顯著差異(P＜0.01)。33258細(xì)胞核染色顯示壞死與凋亡，細(xì)胞核濃縮和絮狀改變，核邊集。 結(jié)論：HMME-SDT能顯著抑制腫瘤增殖活性，增殖活性受抑制可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，膜損傷有關(guān)。 第三部分血卟啉單甲醚聲動(dòng)力作用對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106移植瘤的抑制效應(yīng) 目的：觀察血卟啉單甲醚在UMR-

8、106細(xì)胞移植瘤大鼠組織分布情況，以及其聲動(dòng)力效應(yīng)對(duì)移植瘤的抑制作用。 方法：靜脈注射血卟啉單甲醚，在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)高效液相熒光檢測(cè)法(HPLC)檢測(cè)血卟啉單甲醚在UMR-106移植瘤大鼠肝，肌肉，腫瘤組織達(dá)到期峰值的時(shí)間，確定最佳的超聲輻照時(shí)間。UMR-106移植瘤大鼠分對(duì)照組(C組)、單純HMME組(HMME組)、單純超聲組(U組)、聲動(dòng)力組(SDT組)，處理后觀察其腫瘤體積和重量改變，了解抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤組織石臘包埋、切片

9、，HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)行免疫組化染色、IPP圖像分析PCNA、TUNNEL的表達(dá)情況，探討其抑抗瘤機(jī)制。 結(jié)果：尾靜脈注射HMME后，3小時(shí)腫瘤組織中HMME濃度達(dá)峰值。靜脈注射HMME，3小時(shí)后聲動(dòng)力處理，SDT組與其它對(duì)照組比較，腫瘤的體積和重量減小，差異顯著性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。腫瘤組織石臘切片，IPP圖像分析PCNA表達(dá)下降，TUNNEL表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 結(jié)論：