ATRA通過調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、研究目的:骨肉瘤是一種好發(fā)于兒童或青少年時期最常見的高度惡性骨腫瘤，高轉(zhuǎn)移潛能是骨肉瘤最主要的特性，也是當(dāng)前限制患者生存率進(jìn)一步提高的關(guān)鍵因素。因此如何有效地控制轉(zhuǎn)移的發(fā)生一直是骨肉瘤治療研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c。抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM) M2型極化的抗腫瘤轉(zhuǎn)移策略受到廣泛關(guān)注，但在骨肉瘤的研究中尚處于起步階段，特別是TAM的M2型極化對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響尚未見文獻(xiàn)報道。近年來研究報道全反武維甲酸（ATRA）可抑制多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程

2、，但其分子機(jī)制并不明確，也無其抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)報道。本部分研究將首先考察巨噬細(xì)胞M2型極化對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響，然后以巨噬細(xì)胞極化為模型研究ATRA對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用，并深入探討ATRA對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的實驗治療作用，最后闡明ATRA抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本課題旨在明確巨噬細(xì)胞極化調(diào)控骨肉瘤轉(zhuǎn)移的作用，并闡明ATRA干預(yù)巨噬細(xì)胞極化和骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的治療提供新思路。
　　研究方法:本研究采用小鼠巨噬細(xì)胞

3、和骨肉瘤細(xì)胞株作為研究對象。(1) SRB法檢測ATRA對巨噬細(xì)胞增殖以及巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響;(2)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞膜表面抗原F4/80、CD206和CD86的表達(dá)來考察ATRA對巨噬細(xì)胞極化的影響;(3)H&E染色檢測骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移灶點;(4)免疫組化檢測腫瘤石蠟組織切片中巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白和MMP12蛋白的表達(dá);(5)免疫熒光染色檢測冰凍切片樣本中巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移組織里的表達(dá);(6)Real-

4、time PCR檢測M1和M2型兩類巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平;(7)Transwell小室法和劃痕修復(fù)檢測骨肉瘤細(xì)胞的運動遷移及侵襲能力;(8)建立鼠源性骨肉瘤細(xì)胞K7M2 WT的balb/c小鼠尾靜脈或原位接種模型來模擬骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移情況，考察巨噬細(xì)胞對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響以及ATRA抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的作用;(9)表達(dá)譜芯片分析相關(guān)差異基因的表達(dá);(10)ELISA檢測相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌情況。
　　研究結(jié)果:(1)采用尾靜

5、脈注射的方式將鼠源性骨肉瘤細(xì)胞株K7M2 WT單獨或與巨噬細(xì)胞混合后接種于balb/c小鼠建立了骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型，在此模型上研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。(2)體外采用傳代巨噬細(xì)胞系RAW264.7和原代巨噬細(xì)胞BMDM，應(yīng)用經(jīng)典的IL-13或IL-4誘導(dǎo)其發(fā)生M2型巨噬細(xì)胞極化，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATRA可有效抑制由IL-13或IL-4誘導(dǎo)的CD206表達(dá)，Real time

6、 PCR結(jié)果也證實了ATRA可以明顯抑制M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物MRC1和PPAR-γ的mRNA水平;另一方面，采用IFN-γ和LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)ATRA可以一定程度上促進(jìn)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞的M1型極化，但對于原代巨噬細(xì)胞BMDM的M1型極化卻沒有影響。(3)進(jìn)一步考察ATRA的體外抗骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用，研究結(jié)果表明ATRA可以抑制由IL-13或IL-4刺激的M2型巨噬細(xì)胞上清誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞株的運動遷移能力。

7、(4)采用尾靜脈接種和原位接種鼠源性骨肉瘤細(xì)胞K7M2WT的balb/c小鼠建立了兩種骨肉瘤轉(zhuǎn)移模型，在這兩個動物模型上深入評價了ATRA在體內(nèi)抗骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的作用。H&E染色檢測骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移灶點數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果表明ATRA在體內(nèi)的抗骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移作用十分良好，同時通過與巨噬細(xì)胞抑制劑氯膦酸鹽脂質(zhì)體(Clodronate liposome)共同作用后，我們發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化可能是ATRA阻斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移作用的主要途徑。進(jìn)一步免疫

8、組化結(jié)果證實ATRA可以有效抑制肺轉(zhuǎn)移組織中的M2型巨噬細(xì)胞，而對M1型巨噬細(xì)胞沒有顯著影響。(5)采用基因芯片分析探討了ATRA調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MMP12可能是其潛在作用靶點。ELISA結(jié)果顯示ATRA可以減少巨噬細(xì)胞中由IL-13刺激的MMP12分泌。引入MMP12抑制劑mmp408，發(fā)現(xiàn)mmp408可以有效抑制由IL-13和IL-4刺激的M2型巨噬細(xì)胞上清誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞株K7M2 WT的運動遷移和侵襲能力。免疫組