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文檔簡介
1、目的: 增生性瘢痕(HS)是成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的纖維化疾病,是醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題。本文研究以血卟啉單甲醚(HMME)為光敏劑的光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)對瘢痕成纖維細(xì)胞(HSF)增殖與功能的影響并初步探討其作用機(jī)制,在動(dòng)物瘢痕模型上觀察HMME-PDT的生物學(xué)效應(yīng),為臨床應(yīng)用HMME-PDT防治增生性瘢痕提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.HSF對HMME的吸收特性及HMME-PDT對其增殖效應(yīng)的研究:
2、取原代培養(yǎng)的第4~6代HSF,經(jīng)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測孵育濃度(0~40μg/ml)和孵育時(shí)間(0~120min)對HSF細(xì)胞吸收HMME的影響;MTT法檢測HMME-PDT對HSF細(xì)胞存活率的影響;銀染法檢測HSF中核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白(AgNORs)的表達(dá)情況;FCM分析細(xì)胞周期的變化。 2.HMME-PDT對HSF中TGF-β1/Smad信號通路的影響:用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測HMME-PDT后HSF分泌至上
3、清液的TGF-β1蛋白表達(dá)量;用Smad3-FITC標(biāo)記后在熒光顯微鏡上觀察細(xì)胞內(nèi)Smad3的熒光強(qiáng)度;將細(xì)胞分為對照組、光敏劑組、照光組和HMME-PDT組,經(jīng)Western-blot方法檢測各組細(xì)胞漿內(nèi)TGF-β1、磷酸化和非磷酸化Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)量。 3.HMME-PDT誘導(dǎo)HSF凋亡效應(yīng)的研究:Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡上觀察HMME-PDT后HSF細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;Annexin V-FI
4、TC-PI雙染后經(jīng)FCM檢測HMME-PDT后HSF細(xì)胞凋亡率和壞死率;將HSF爬片后分為對照組、HMME-PDT組和Z-DEVD-FMK抑制劑組,Caspase3-FITC-PI染色后在熒光顯微鏡上觀察各組細(xì)胞內(nèi)Caspase3的熒光強(qiáng)度;收集各組細(xì)胞在active-Caspase3-FITC單染后經(jīng)FCM檢測active-Caspase3陽性細(xì)胞百分率;收集各組細(xì)胞在PI單染后經(jīng)FCM檢測細(xì)胞凋亡率。 4.HMME-PDT對
5、兔耳瘢痕的效應(yīng)研究:建立兔耳瘢痕模型后,將瘢痕塊分為不同組別,照光功率密度為20mW/cm2,光敏劑劑量為10mg/kg,分別在給藥后即刻、0.5、1、3h給予2.5、5、10、20J/cm2的能量密度照光,治療后第10天用游標(biāo)卡尺測量并計(jì)算瘢痕增生指數(shù)(HI);HE染色后觀察瘢痕厚度、細(xì)胞及膠原分布等形態(tài)學(xué)變化;觀察HMME-PDT后瘢痕中微血管數(shù)量、形態(tài)變化,采用Weidner計(jì)數(shù)方法,計(jì)算平均微血管密度(MVD);運(yùn)用透射電鏡觀察
6、兔耳瘢痕增生塊中成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果: 1.在一定孵育濃度范圍內(nèi)(0~40μg/ml),HSF細(xì)胞對HMME的吸收量隨孵育濃度的增高和孵育時(shí)間的增加而增大。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的HMME-PDT對HSF細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與孵育濃度和激光能量密度正相關(guān);HMME-PDT能夠減少HSF細(xì)胞中AgNORs的含量,使I.S%值降低;HMME-PDT降低HSF增殖指數(shù),改變各期細(xì)胞的分布比例,抑制S期DNA合成,使細(xì)胞滯留在G0/G
7、1期。 2.HSF分泌至細(xì)胞上清液的TGF-β1蛋白含量較高,而HMME-PDT后降低;HSF合成的TGF-β1蛋白水平高,HMME-PDT后HSF中的TGF-β1和磷酸化Smad3蛋白含量減少,Smad7蛋白含量增加,光敏劑組和照光組中上述蛋白的表達(dá)無顯著改變;PDT不能改變HSF內(nèi)Smad3蛋白表達(dá)量,但其在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生變化,進(jìn)入細(xì)胞核的Smad3蛋白減少。 3.HMME-PDT治療后細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚,呈團(tuán)塊
8、顆粒狀,或呈波紋狀、折縫樣改變;Annexin V-FITC-PI雙染結(jié)果表明PDT后凋亡率顯著升高,并伴有細(xì)胞壞死的發(fā)生,但組內(nèi)壞死率低于凋亡率;對照組和Z-DEVD-FMK抑制劑組HSF的細(xì)胞漿中Caspase3-FITC熒光微弱,PDT組熒光顯著增強(qiáng);對照組active-Caspase-3陽性細(xì)胞百分率低,HMME-PDT組上升,Z-DEVD-FMK組降低;PI染色分析表明對照組凋亡率低,PDT組的凋亡率顯著升高,Z-DEVD-F
9、MK組的凋亡率低于PDT組,但仍然顯著高于對照組。 4.在本研究的兔耳增生性瘢痕塊中,靜脈注射HMME10mg/kg后30min,給予功率密度為20mW/cm2,能量密度為5J/cm2的630nm紅光照射能對瘢痕塊產(chǎn)生較理想的抑制效應(yīng);對照組兔耳瘢痕塊真皮層顯著增厚,血管分布豐富,HMME-PDT組瘢痕塊厚度下降,MVD顯著減少;在透射電鏡下觀察到對照組中有大量HSF,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,高爾基體發(fā)達(dá),線粒體增加,PDT組胞漿
10、內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)萎縮且數(shù)量減少,核蛋白體有不同程度的脫顆粒和解聚,胞質(zhì)中見較多游離核糖體,線粒體腫脹,嵴溶解。 結(jié)論: 1.HSF對HMME的吸收隨孵育濃度和孵育時(shí)間的增加而增加,HMME-PDT處理HSF時(shí),光敏劑孵育濃度和激光能量密度是影響細(xì)胞存活率的重要因素,PDT改變各期細(xì)胞的分布比例,抑制細(xì)胞增殖。 2.HMME-PDT能夠阻止TGF-β1的信號經(jīng)由Smad蛋白傳向細(xì)胞核,改變TGF-β1、磷酸化Smad3
11、和Smad7在HSF細(xì)胞水平的表達(dá),使細(xì)胞增殖及膠原合成有關(guān)的靶基因得不到激活,從而抑制HSF增殖和膠原合成。 3.HMME-PDT誘導(dǎo)HSF發(fā)生的凋亡效應(yīng)與Caspase-3的激活密切相關(guān),但該凋亡效應(yīng)并不依賴于Caspase-3,可能與AIF等因子的釋放或其它信號途徑的激活有關(guān)。 4.HMME-PDT對兔耳增生性瘢痕的生物學(xué)效應(yīng)是一個(gè)光動(dòng)力綜合作用的結(jié)果,與光敏劑的劑量和激光照光時(shí)間、給藥后至照光的時(shí)間間隔及能量密度
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