利用羊膜上皮干細胞抑制皮膚增生性瘢痕形成的研究.pdf

1、病理性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷修復過程中異常增生所致，主要包括增生性瘢痕（Hypertrophic Scar，HS）和瘢痕疙瘩（Keloid，K）。兩者組織學特點都是成纖維細胞增值，細胞外基質(zhì)過度分泌、膠原過度沉積。臨床表現(xiàn)為瘙癢、疼痛、嚴重可導致關節(jié)的功能障礙等。目前增生性瘢痕的發(fā)生機制尚不明確，且臨床治療復雜及困難。所以對抑制皮膚瘢痕形成的研究就尤為重要。
　　研究表明瘢痕的形成因素之一是多種炎性因子參與的病理過程，使正常的創(chuàng)面愈合結(jié)果

2、變?yōu)轳：鄣男纬?。文獻報道，Gordon等利用小鼠傷口組織，采用腺病毒介導的IL-10轉(zhuǎn)染的方法，證實過表達的IL-10可以明顯的抑制傷口炎癥反應，從而減少瘢痕的形成，進一步驗證了抗炎癥策略在防止瘢痕的形成，以及治療中具有重要作用。
　　羊膜是胎膜的一部分，包括來源于胚胎外胚層的上皮細胞（Human amniotic epithelial cells,hAECs）和胚胎中胚層的間質(zhì)細胞（Human amniotic mesenchy

3、mal cells,hAMCs），羊膜上皮細胞具有部分干細胞特性，可分化為三個胚層不同類型的細胞?，F(xiàn)臨床以成功的應用在眼科，利用羊膜上皮細胞的干細胞特性，通過抑制炎癥反應治療角膜潰瘍和翼狀胬肉等疾病。
　　本實驗通過構(gòu)建兔耳瘢痕模型，利用羊膜上皮干細胞抑制炎癥因子、免疫源性極低等優(yōu)點，在創(chuàng)面周圍定期注射羊膜上皮干細胞懸液，研究羊膜上皮干細胞抑制瘢痕形成中所起的作用。為增生性瘢痕的防治和治療開辟一條新的道路。
　　第一部分實驗

4、：羊膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　1.主要方法：
　　從胎膜組織中分離羊膜組織，采用胰蛋白消化法、LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的羊膜上皮細胞分別進行流式細胞術、免疫熒光染色、成骨成脂多向分化等實驗進行干細胞特性的鑒定。
　　2.主要結(jié)果：
　　FCM結(jié)果顯示不同程度的陽性表達CD29、CD90、CD105，CD34、CD45為陰性。其中陽性率最高的是CD29，說明羊膜上皮細胞兼有間充質(zhì)干細胞的表型

5、特征。免疫熒光染色顯示SSEA-4，Oct-4均有陽性表達。hAECs成功定向誘導成脂成骨。
　　3.主要結(jié)論：
　　羊膜上皮細胞具有一般干細胞的特性。
　　第二部分實驗：瘢痕成纖維細胞的分離、培養(yǎng)
　　1.主要方法：
　　取外科手術中廢棄的增生性瘢痕組織，采用組織快培養(yǎng)法、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2.主要結(jié)果：
　　原代培養(yǎng)時間較長，大約1周時間有少許細胞從組織塊周圍爬出，生長較快，鏡下觀察

6、，細胞為長梭形，較正常皮膚成纖維細胞略短。
　　3.主要結(jié)論：
　　成功的培養(yǎng)出瘢痕的成纖維細胞。
　　第三部分實驗：羊膜上皮細胞與瘢痕成纖維細胞的共培養(yǎng)及鑒定
　　1.主要方法：
　　將羊膜上皮細胞種于6孔板中，待完全貼壁時，3個孔放入Transwell,另外3個孔為對照，將瘢痕成纖維細胞種于Transwell中,加入IL-6炎性因子刺激下，讓兩種細胞共同培養(yǎng)，分別在共培養(yǎng)的1、2、3天提取RNA，進行細

7、胞周期、細胞凋亡及PCR檢測。
　　2.主要結(jié)果：
　　細胞周期結(jié)果顯示1d，3d的實驗組中瘢痕成纖維細胞增殖要低于對照組，說明羊膜上皮細胞對瘢痕成纖維細胞的增殖有抑制作用。細胞凋亡結(jié)果顯示1d、3d實驗組瘢痕成纖維細胞凋亡的比對照組數(shù)值略高。PCR檢測顯示，實驗組的OCT-4、Ι型膠原較對照組高，而TIMP-1低于對照組。
　　3.主要結(jié)論：
　　兩種細胞共培養(yǎng)后，羊膜上皮細胞對瘢痕成纖維細胞的增殖和凋亡有作用

8、，PCR檢測TIMP-1、OCT-4、Ι型膠原等指標隨著時間不同各自的表達不同。
　　第四部分實驗：利用動物模型檢測羊膜上皮細胞在瘢痕防治中的作用
　　1.主要方法：
　　手術切除雙側(cè)兔耳內(nèi)側(cè)面，形成直徑為1×1cm的4個方形全層皮膚缺損；在右耳創(chuàng)面周圍注射羊膜上皮細胞懸液，左耳創(chuàng)面周圍注射PBS緩沖液。每周注射一次，定期觀察。4周后實驗組創(chuàng)面完全上皮化，腫塊較小。對照組腫塊明顯。取瘢痕組織進行HE染色及激光共聚焦觀察

9、。
　　2.主要結(jié)果：
　　HE染色結(jié)果顯示實驗組上皮化完全、略顯增生狀態(tài)，基底層細胞排列明顯，其下的真皮組織中未見炎性細胞分布，成纖維細胞分布與對照組相比較為分散。共聚焦可觀察到移植的羊膜上皮細胞。對照組HE染色顯示成纖維細胞分布集中，增生明顯。共聚焦未見羊膜上皮細胞。
　　3.主要結(jié)論：
　　通過肉眼觀察、HE染色及共聚焦檢測，說明羊膜上皮干細胞有效的抑制瘢痕的形成。
　　綜上所述，本實驗利用羊膜上皮細