利用組織工程皮膚研究表皮干細(xì)胞在增生性瘢痕中的防治作用.pdf

1、增生性瘢痕是以膠原過度沉積為特征的一種病理現(xiàn)象，其誘發(fā)的具體機(jī)理目前仍不清楚。由于成纖維細(xì)胞是瘢痕形成的效應(yīng)細(xì)胞，所以以往的研究都以此為重點(diǎn)。但是隨著研究的不斷深入，表皮細(xì)胞在瘢痕形成中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。 早在1998年Warren等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就表明，正常表皮細(xì)胞的上清液對瘢痕成纖維細(xì)胞膠原分泌的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于瘢痕表皮細(xì)胞，并在一定的范圍內(nèi)具有濃度依賴性。2005年Belemare等采用組織工程皮膚模型檢測表皮細(xì)胞對

2、真皮組織的影響，其研究結(jié)果表明，與正常表皮細(xì)胞相比，瘢痕來源的表皮細(xì)胞可促使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生更多的Ⅰ型膠原，導(dǎo)致更厚的真皮組織的形成，從而顯示瘢痕來源的表皮細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)真皮纖維化的能力。已經(jīng)有越來越多的研究結(jié)果證明，異常的表皮—真皮相互作用關(guān)系在增生性瘢痕的發(fā)生中起著非常重要的作用。但是何種原因?qū)е逻@種異常作用關(guān)系的出現(xiàn)，現(xiàn)在還不明確。 我們知道表皮的更新依靠表皮干細(xì)胞完成，它可以分化為表皮全層細(xì)胞，是表皮組織中最重要的細(xì)胞成

3、分。表皮干細(xì)胞分布于真皮上方的基底層，是與真皮成纖維接觸最密切的表皮細(xì)胞，它的存在是維持表皮—真皮正常作用關(guān)系的基礎(chǔ)。研究表明，當(dāng)皮膚受到嚴(yán)重外傷時(shí)，表皮干細(xì)胞進(jìn)入一種“激活狀態(tài)”，它們反復(fù)分裂、增殖，并發(fā)生異常分化，最終失去了原有的干細(xì)胞特性。對修復(fù)后的增生性瘢痕的研究也顯示，瘢痕表皮的基底層薄，各種細(xì)胞器欠發(fā)達(dá)，功能低下，有別于正常表皮；瘢痕表皮細(xì)胞培養(yǎng)后與正常表皮細(xì)胞相比，細(xì)胞含量少，成活率低。由此我們推測，皮膚創(chuàng)傷的過度修復(fù)可能

4、導(dǎo)致表皮組織中細(xì)胞成分的改變，尤其是一些重要的功能性細(xì)胞(例如表皮干細(xì)胞)的喪失，這些細(xì)胞成分的缺失或減少可能是導(dǎo)致表皮—真皮間異常的重要原因，是誘發(fā)瘢痕增生的因素之一。 本研究觀察了增生性瘢痕中表皮干細(xì)胞分布、數(shù)量等的變化，并利用組織工程皮膚模型模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察其對真皮成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，初步探索了具有干細(xì)胞性質(zhì)的表皮細(xì)胞在瘢痕發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，并為組織工程皮膚在瘢痕預(yù)防和治療中的應(yīng)用奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

5、 本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.正常皮膚與瘢痕皮膚中表皮干細(xì)胞表達(dá)的差異 選取兩種與表皮干細(xì)胞標(biāo)志分子相對應(yīng)的抗體(抗β1整合素抗體和抗CK19抗體)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法，觀察表皮干細(xì)胞在增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中分布和數(shù)量的差異。 檢測結(jié)果顯示，在瘢痕皮膚中表皮層次異常，厚度增加，β1整合素和CK19的表達(dá)呈陰性或極微弱的表達(dá)；而正常皮膚中表皮較薄，細(xì)胞層次分明，β1整合素和CK19具有明確的

6、強(qiáng)陽性表達(dá)，而且陽性細(xì)胞僅僅局限于基底層。說明瘢痕皮膚中表皮干細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常皮膚，甚至缺如。這一結(jié)果與臨床上觀察到的瘢痕皮膚再損傷后，表皮細(xì)胞增殖能力明顯下降，愈合困難的現(xiàn)象相一致。 由此推斷表皮干細(xì)胞或與之密切相關(guān)的細(xì)胞(例如，短暫擴(kuò)充細(xì)胞)的缺失或減少可能是導(dǎo)致瘢痕皮膚中，表皮細(xì)胞對成纖維細(xì)胞分泌抑制作用減弱的重要因素之一。為了證明這一假設(shè)，進(jìn)行了以下的實(shí)驗(yàn)。 2.富含表皮干細(xì)胞的組織工程皮膚的構(gòu)建 取

7、外科手術(shù)中廢棄的包皮組織，分別進(jìn)行表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)增。利用免疫磁珠分離技術(shù)獲得以表皮干細(xì)胞為主的細(xì)胞群(β1整合素陽性)，通過免疫組織化學(xué)對分離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，從而確定細(xì)胞分離的有效性。在不使用任何外源性支架材料的情況下完全依靠成纖維細(xì)胞自身分泌胞外基質(zhì)形成真皮組織，然后將前述分離獲得的表皮干細(xì)胞群種植其上，構(gòu)建組織工程全層皮膚，觀察此細(xì)胞群體在體外構(gòu)建組織工程全層皮膚的能力，并分析將其用于增生性瘢痕研

8、究的可行性。同時(shí)利用未經(jīng)篩選的表皮細(xì)胞(即混合表皮細(xì)胞)構(gòu)建組織工程皮膚作為對照。 結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞狀態(tài)良好。經(jīng)過免疫磁珠篩選的表皮細(xì)胞99％以上為β1整合素表達(dá)陽性的細(xì)胞。將篩選后的表皮細(xì)胞用于組織工程全層皮膚的構(gòu)建，HE染色結(jié)果表明，體外構(gòu)建的組織工程皮膚均具有類似正常皮膚真皮和表皮的結(jié)構(gòu)。在利用表皮干細(xì)胞群構(gòu)建的組織工程皮膚中，表皮組織有明顯的細(xì)胞層次，位于基底部的細(xì)胞呈規(guī)則的柵欄狀排列；免疫熒

9、光染色可見，其基底部位仍有β1整合素的表達(dá)，而且僅僅局限于基底層細(xì)胞，其余細(xì)胞各層則未見β1整合素的表達(dá)；透射電鏡觀察結(jié)果顯示，位于此處的細(xì)胞連接緊密，多見橋粒形成。對照組表皮中細(xì)胞層次不明顯，基底細(xì)胞排列不整齊，且該處細(xì)胞少見橋粒形成，免疫熒光染色未見表皮組織中有β1整合素的表達(dá)。 體外構(gòu)建結(jié)果說明，應(yīng)用表皮干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚更接近于正常皮膚的結(jié)構(gòu)特征，如果將其用于增生性瘢痕的研究，可更有效地模擬正常皮膚中表皮-真皮的相

10、互作用關(guān)系。 3.利用組織工程皮膚模型檢測表皮干細(xì)胞對真皮纖維化及其相關(guān)因子的影響 應(yīng)用透射電鏡、RT-PCR和Westernblot等手段檢測在組織工程皮膚模型中表皮干細(xì)胞對真皮的胞外基質(zhì)形態(tài)、真皮纖維化的標(biāo)志產(chǎn)物——Ⅰ型膠原分泌的影響，以及纖維化相關(guān)因子bFGF和TGF-β1表達(dá)水平的變化。 透射電鏡觀察顯示，在應(yīng)用表皮干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚的真皮組織中，成纖維細(xì)胞狀態(tài)相對靜止，胞膜少見分泌性小泡，細(xì)胞外的

11、基質(zhì)分布較為均勻，沒有束狀膠原或膠原密集排列現(xiàn)象出現(xiàn)。而在應(yīng)用混合表皮細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚的真皮組織中，成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)出活躍的功能狀態(tài)，胞膜多見分泌性小泡；在胞外基質(zhì)中，分泌的膠原排列密集，有的區(qū)域甚至呈明顯的束狀排列；RT-PCR和Westernblot檢測顯示，表皮干細(xì)胞構(gòu)建組中，Ⅰ膠原和TGF-β1無論在mRNA表達(dá)水平還是蛋白表達(dá)水平均低于混合細(xì)胞構(gòu)建組，而bFGF的表達(dá)水平明顯高于混合細(xì)胞組。 由此證明，表皮干細(xì)胞對

12、真皮成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為有重要的影響，能夠明顯抑制真皮組織的纖維化；表皮干細(xì)胞所介導(dǎo)的bFGF、TGF-β1的表達(dá)水平的改變可能是其實(shí)現(xiàn)對真皮纖維化調(diào)節(jié)作用的途徑之一。 4.利用動物模型檢測表皮干細(xì)胞在瘢痕防治中的作用 制備兔耳全層皮膚缺損，應(yīng)用富含表皮干細(xì)胞的組織工程皮膚，在體內(nèi)環(huán)境下進(jìn)一步確定表皮干細(xì)胞在增生性瘢痕中的防治作用。 組織工程皮膚修復(fù)2w后，混合細(xì)胞組肉眼觀，創(chuàng)面結(jié)痂并有增生的腫塊出現(xiàn)，已經(jīng)上皮

13、化的創(chuàng)面邊緣略高于正常皮面；而表皮干細(xì)胞組創(chuàng)面已經(jīng)完全上皮化，修復(fù)的皮膚沒有腫塊或硬結(jié)出現(xiàn)，創(chuàng)面平整。經(jīng)組織切片、HE染色后顯示，混合細(xì)胞組上皮化不完全，創(chuàng)面下有炎癥細(xì)胞分布，并聚集有大量的成纖維細(xì)胞，纖維增生和毛細(xì)血管增生明顯，有的區(qū)域可見膠原纖維漩渦狀排列；而在表皮干細(xì)胞組中創(chuàng)面上皮化完全，修復(fù)的表皮組織細(xì)胞層次明顯，略顯過度增生狀態(tài)，基底層細(xì)胞排列整齊，其下的真皮組織中未見或少見炎性細(xì)胞分布，成纖維細(xì)胞的分布與對照組相比較為分散。

14、 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，表皮干細(xì)胞的應(yīng)用可以促進(jìn)傷口的愈合，有效抑制兔耳創(chuàng)面增生性瘢痕的形成，從而進(jìn)一步確定了表皮干細(xì)胞在瘢痕防治中的作用。 綜上所述，本研究以檢測增生性瘢痕皮膚中表皮干細(xì)胞分布及數(shù)量的異常為介入點(diǎn)，推測具有表皮干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞成分的減少或缺失是引起真皮纖維化的重要因素，并應(yīng)用組織工程方法分別在體外和體內(nèi)證明這一推測的可靠性，從新的角度探討了增生性瘢痕產(chǎn)生的機(jī)理。同時(shí)表明，表皮干細(xì)胞和組織工程皮膚構(gòu)建技術(shù)的結(jié)