人表皮干細(xì)胞復(fù)合裸鼠脫細(xì)胞真皮支架構(gòu)建組織工程皮膚及移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：用組織工程學(xué)原理，通過(guò)體外分離擴(kuò)增人表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，復(fù)合自己制備的異種(裸鼠)脫細(xì)胞真皮支架材料，探討體外構(gòu)建活性組織工程皮膚的可行性。將該組織工程皮膚移植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)面，檢測(cè)和了解該組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)和功能。 方法：用中性蛋白酶消化法，分離小兒包皮的表皮，制成單細(xì)胞懸液，Ⅳ型膠原快速粘附10-15min(37℃)，分別取快速粘附細(xì)胞和未黏附的細(xì)胞培養(yǎng)。用K-SFM培養(yǎng)基，補(bǔ)充10％的干細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用胎牛血清(FBS

2、)。用免疫組織化學(xué)測(cè)定角蛋白15(CK15)、角蛋白19(CK19)和β1整合素(β1-integrin)和用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD71等指標(biāo)，對(duì)進(jìn)表皮干細(xì)胞行鑒定。以胰蛋白酶法制備(裸鼠)脫細(xì)胞真皮支架，并進(jìn)行組織學(xué)觀察。將分離培養(yǎng)傳代的表皮干細(xì)胞接種于鋪好Ⅳ型膠原的脫細(xì)胞真皮表面，置入干細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，再行氣液界面培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚。HE染色切片觀察組織工程皮膚結(jié)構(gòu)。將組織工程皮膚移植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)面，以單純脫細(xì)胞真皮移植作對(duì)照。肉

3、眼觀察移植后的創(chuàng)面情況，對(duì)移植后的皮膚取材行組織學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)鼠抗人廣譜角蛋白染色確定組織來(lái)源。 結(jié)果：⑴表皮干細(xì)胞能被Ⅳ型膠原快速黏附；⑵黏附的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中后很快貼壁，第3-4d形成一些小集落，其后細(xì)胞逐漸增殖，至第7d左右逐漸有大集落形成。而未黏附的細(xì)胞集落形成早1-2d，集落形成數(shù)明顯少于實(shí)驗(yàn)組。黏附細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性率CK15為50.80％+1.81、CK19為51.40％+2.22、和β1-integri

4、n為51.40％+1.90，CD71陽(yáng)性率約1.91％+0.21。黏附細(xì)胞具有表皮干細(xì)胞特性，陽(yáng)性率與文獻(xiàn)報(bào)道的差別不大。⑶制備的脫細(xì)胞真皮支架呈乳白色，柔軟有彈性，光鏡下見(jiàn)表皮去除，真皮內(nèi)無(wú)其他細(xì)胞成分，膠原纖維結(jié)構(gòu)保存完好，排列有序。⑷表皮干細(xì)胞能快速黏附到由IV型膠原包被的脫細(xì)胞真皮支架上，迅速貼壁生長(zhǎng)，無(wú)排斥反應(yīng)。聯(lián)合培養(yǎng)約兩周后，可融合形成含1-2層細(xì)胞的復(fù)合皮。⑸活性復(fù)合皮移植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)面后，創(chuàng)面愈合良好，未見(jiàn)排斥反應(yīng)，

5、創(chuàng)面收縮不明顯；4周后，移植皮膚取材切片HE染色，光鏡下見(jiàn)創(chuàng)面愈合，皮層含2-3層細(xì)胞，膠原排列整齊，未見(jiàn)皮膚附屬結(jié)構(gòu)。組織工程皮膚鼠抗人廣譜角蛋白染色為陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)照組染色陰性，鼠皮廣譜角蛋白染色陰性，說(shuō)明移植皮膚的皮膚結(jié)構(gòu)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)用的人體種子細(xì)胞，表皮干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。脫細(xì)胞真皮組無(wú)表皮結(jié)構(gòu)形成，表面逐漸干燥、變硬，創(chuàng)面收縮，3周后創(chuàng)面愈合。組織取材HE染色未見(jiàn)表皮層結(jié)構(gòu)形成，為紅染的疤痕樣組織，鼠抗人廣譜角蛋白染色為陰性反應(yīng)

6、。 結(jié)論：①表皮干細(xì)胞能被IV型膠原快速黏附，利用這一特性，可以用來(lái)篩選表皮干細(xì)胞，并在K-SFM培養(yǎng)體系中分裂增殖，產(chǎn)生大量的子代細(xì)胞，可作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞。②胰蛋白酶法制備的異體脫細(xì)胞真皮，能去除表皮層及真皮內(nèi)各種細(xì)胞成分，膠原纖維結(jié)構(gòu)保存完好，可作為組織工程用脫細(xì)胞真皮支架材料。③擴(kuò)增、傳代的第二代表皮干細(xì)胞能快速黏附在預(yù)鋪好IV型膠原的脫細(xì)胞真皮上，在表皮干細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)，聯(lián)合氣液界面培養(yǎng)，能構(gòu)建活性復(fù)層結(jié)構(gòu)