組織工程皮膚種子細胞免疫原性及組織工程皮膚移植SCID鼠的研究.pdf

1、組織工程皮膚是目前治療難治性潰瘍、大面積燒傷等皮膚缺損性疾病最有效的方法之一。組織工程皮膚是采用組織工程學方法，體外分離自體或異體細胞并長期培養(yǎng)和擴增后，與其他天然或合成材料共同構建而成。采用自體細胞雖然避免了免疫排斥反應，但為患者造成了新的創(chuàng)面，并限制了組織工程皮膚的商品化。異體細胞經(jīng)體外長期培養(yǎng)后是否被受體免疫系統(tǒng)識別即免疫原性如何，仍然存在爭論。目前構建組織工程皮膚主要使用角質形成細胞(keratinocyte，KC)、成纖維細胞

2、(fibroblast，F(xiàn)B)作為種子細胞。一般認為這兩種細胞正常情況下僅表達MHC-Ⅰ類抗原，不表達MHC-Ⅱ類抗原及共刺激分子，本身不具備遞呈抗原能力，因此免疫原性較弱。但有實驗顯示在炎癥因子如干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的作用下，上述細胞能誘導HLA-DR的表達。HLA-DR屬于MHC-Ⅱ分子，是專職抗原遞呈細胞(antigenpresentingcell，APC)呈遞抗原的重要結構之一。還有研究者認為KC可

3、通過誘導表達B7分子來向T淋巴細胞傳遞協(xié)同刺激信號，從而激活T淋巴細胞。因此KC、FB能否成為APC，從而激活T細胞需要實驗加以明確。混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗是以研究細胞免疫為主，一定程度上模擬體內(nèi)免疫識別途徑，廣泛應用于研究免疫排斥反應的實驗中。本實驗將不同代KC、FB與異體淋巴細胞混合培養(yǎng)，觀察淋巴細胞的增殖程度，反映異體KC、FB在體外培養(yǎng)的過程中免疫原性的變化情況。 異體細胞移植后是否被受體免疫系統(tǒng)排斥，另一個關鍵之處在于其

4、能否被受體的專職APC所識別。朗格漢斯細胞(langerhanscell，LC)是專職APC，長期定植于皮膚、呼吸道上皮及消化道粘膜上皮中，攝取抗原后向局部淋巴組織遷移，在那里最終分化成熟，激活初始T淋巴細胞，啟動免疫反應或誘導免疫耐受。LC如何識別抗原，激活淋巴細胞的具體機制目前尚不完全清楚。隨著Lc的體外培養(yǎng)成功，對于LC能否識別異體KC、FB的問題能夠進一步深入研究。本實驗采用多種細胞因子聯(lián)合誘導培養(yǎng)LC，將培養(yǎng)的LC與異體KC、

5、FB混合培養(yǎng)后，觀察LC的表型變化情況，反映LC對異體KC、FB的識別情況。 組織工程皮膚支架材料也是影響其免疫原性的一個重要因素，組織工程皮膚采用的支架材料主要分為合成高分子材料及天然高分子材料，目前的研究主要集中于支架材料的生物毒性和降解性等，對其免疫原性的研究較少。動物膠原屬于天然高分子材料，是由動物細胞合成，是細胞外間質的主要成分，因其易于獲取，在組織工程皮膚支架材料中的應用最為廣泛，雖然不同種類的動物分離出來的膠原極其

6、相似，但畢竟屬于異種蛋白，植入后是否具有免疫原性，有必要系統(tǒng)地研究。 組織工程皮膚免疫原性的研究進展緩慢，其中一個主要原因就是移植于人體的臨床研究受到倫理學等多方面的制約；另外長期缺乏一種良好的能夠模擬人體免疫內(nèi)環(huán)境的實驗動物也影響了深入研究。重度聯(lián)合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency，SCID)鼠是細胞免疫、體液免疫均缺陷的動物，容易植入人的免疫細胞和組織，構建人的免疫系統(tǒng)。有實驗顯示植入S

7、CID鼠的人淋巴細胞能夠長期存活，仍然保持排斥異體移植物的特性。另有實驗將人皮膚移植于SCID鼠后，移植的人皮膚能長期維持正常的皮膚結構，以上特點將使SCID鼠成為研究組織工程皮膚免疫原性的一個有力工具。本實驗將組織工程皮膚、人皮膚和無細胞真皮支架移植于SCID鼠后，植入異體人脾淋巴細胞后觀察組織工程皮膚三者的免疫排斥跡象，從組織水平反映組織工程皮膚的免疫原性?，F(xiàn)將本實驗方法、結果和結論分述如下： 方法： 1.采用組織工

8、程的方法分離培養(yǎng)KC、FB，并不斷傳代。將不同代的KC、FB與異體淋巴細胞混合培養(yǎng)，觀察淋巴細胞的增殖程度。CD1a標記LC，流式細胞儀測不同代數(shù)KC中混雜的LC的變化情況，以及KC在不同培養(yǎng)體系下細胞表面CD80、CD86的變化情況，從細胞水平觀察組織工程皮膚種子細胞的免疫原性。 2.體外采用多種細胞因子聯(lián)合誘導外周血單核細胞分化發(fā)育為LC，流式細胞儀測細胞表面CD1a、HLA-DR、CD80、CD86和CD83的表達情況，電

9、鏡鑒定培養(yǎng)的細胞為LC。將純化的KC、FB分別與LC共培養(yǎng)后測LC的細胞表型的變化情況，從細胞水平觀察LC對異體KC、FB的識別情況。 3.將體外分離的不同數(shù)量的人脾淋巴細胞注入SCID鼠腹腔內(nèi)，觀察SCID鼠的生長情況，流式細胞測鼠血中人淋巴細胞的分類情況，ELISA法測鼠血中人IgG的含量，摸索出一條穩(wěn)定植入人脾淋巴細胞的實驗方法。 4.將組織工程皮膚、人包皮、無細胞真皮支架移植于SCID鼠，隨后植入異體人脾淋巴細胞

10、后，用組織學和免疫組織化學的方法觀察組織工程皮膚等的免疫排斥跡象，從組織水平反映組織工程皮膚整體的免疫原性。 結果： 1.原代～4代KC、原代FB能顯著刺激異體淋巴細胞增殖。流式細胞儀分析顯示KC中混雜的LC逐漸減少，5代后無法測出LC的存在。KC刺激異體淋巴細胞增殖與其中混雜的LC明顯相關。5代KC在無血清、有血清和PHA存在的培養(yǎng)體系均無法檢測出細胞表面CD80、CD86的表達。 2.人外周血單核細胞在GM-

11、CSF、IL-4、TGF-β1的聯(lián)合誘導下，分化發(fā)育為LC，流式細胞儀顯示細胞高表達CD1a，低表達HLA-DR、CD80、CD86，不表達CD83，電鏡下觀察到LC的特殊結構birbeck小體。與純化的KC、FB共培養(yǎng)后LC的CD80、CD86和CD83無明顯改變，也不能明顯刺激同源淋巴細胞增殖。 3.將3×107人脾淋巴細胞植入SCID鼠后，動物無明顯的移植物抗宿主反應。2周至10周鼠血中分離出的淋巴細胞均測得T細胞、B細胞

12、、NK細胞。其中T、B細胞的百分比8周達到峰值，分別為18.2±0.4，％和7.5±0.3％。鼠血中人IgG10周達到182.51±4.96ug/ml。 4.組織工程皮膚、人包皮移植于SCID鼠后能維持其正常人皮膚組織結構，植入異體淋巴細胞后，組織工程皮膚未發(fā)生明顯的免疫排斥反應，人包皮則發(fā)生了明顯的免疫排斥反應。 結論： 本實驗將組織工程皮膚種子細胞與異體淋巴細胞混合培養(yǎng)，純化后種子細胞不能顯著刺異體激淋巴細胞