不同代次角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚的比較研究.pdf

1、皮膚是人體的第一道防御屏障,最易受到各種損傷和疾病的傷害而導(dǎo)致皮膚缺損,組織工程皮膚產(chǎn)品的研發(fā)為皮膚缺損的治療提供了新的手段。角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建表皮結(jié)構(gòu)為外層皮膚提供有利的物理屏障。但是體外角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)易出現(xiàn)分化、增殖能力有限、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn),因此通過(guò)研究角質(zhì)形成細(xì)胞及其傳代后細(xì)胞在組織工程皮膚的增殖分化情況,可以為我們篩選更優(yōu)代次的種子細(xì)胞提供依據(jù)。
　　目的:
　　1、比較三維培養(yǎng)條件下,不同代次角質(zhì)形成細(xì)胞在真皮層

2、上的分化增殖能力。
　　2、初步觀察外源性Ⅳ型膠原對(duì)基底膜及表皮形態(tài)的變化情況影響。
　　3、了解角蛋白、絲聚合蛋白在不同代次角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建人工皮膚中的變化情況。
　　方法:
　　1、酶消化分離青年男性包皮標(biāo)本獲得角質(zhì)形成細(xì)胞,用Ⅳ型膠原粘附法進(jìn)行分選,并用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,觀察1~5代次角質(zhì)形成細(xì)胞在二維條件下的生長(zhǎng)狀況;用1~5代次角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程皮膚,分為在表真皮之間加入

3、外源性Ⅳ型膠原組及不加Ⅳ型膠原組,通過(guò)HE、PAS染色及電鏡,觀察各組組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)形態(tài)及基底膜形成狀況。
　　2、取2代角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚,通過(guò)MTT法比較不同密度表皮內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況;同時(shí)在密度一定條件下,構(gòu)建1、3、5代次角質(zhì)形成細(xì)胞的組織工程皮膚,用MTT法檢測(cè)各代次表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;并利用CK1/CK10、CK5/CK14、Ki67免疫組化染色比較各組組織工程皮膚表皮的增殖分化能力。
　　3

4、、用Westernblot檢測(cè)絲聚合蛋白在各代次表皮的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、1~5代次角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚都有明顯的表真皮結(jié)構(gòu)。1代、2代較其他代次的分層情況好,且含有黑色素細(xì)胞;2代表皮層厚度明顯高于其他代次(P<0.05)。
　　2、加Ⅳ型膠原組的表真皮間粘附的緊密程度高于未加Ⅳ型膠原組,Ⅳ型膠原對(duì)表皮層的厚度影響不大(P>0.05)。Ⅳ型膠原組PAS染色陰性,說(shuō)明單獨(dú)加Ⅳ型膠原在培養(yǎng)時(shí)間非常有

5、限的情況下難以形成基底膜結(jié)構(gòu)。
　　3、在5×104/ml~2×105/ml細(xì)胞范圍內(nèi),組織工程皮膚的表皮中接種的角質(zhì)形成細(xì)胞量越大,越有利于加快細(xì)胞增殖速度,并且前2代角質(zhì)形成細(xì)胞增殖活力較好。
　　4、2代角質(zhì)形成細(xì)胞ki67增殖系數(shù)接近正常皮膚,其余各代次角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖系數(shù)逐漸減少(P<0.05)。
　　5、CK1/CK10、CK5/CK14在1、2代皮膚中陽(yáng)性表達(dá)明顯,其余代次對(duì)于兩種角蛋白的表達(dá)并不明顯。

6、
　　6、絲聚合蛋白在各代次角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的表皮中都能表達(dá),以1、2代角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)居多。
　　結(jié)論:
　　本研究在三維培養(yǎng)條件下,對(duì)組織工程皮膚的種子細(xì)胞即角質(zhì)形成細(xì)胞及傳代細(xì)胞進(jìn)行比較研究,合適用作種子細(xì)胞的代次是1、2代;Ⅳ型膠原是基底膜重要的組成成分,外源性Ⅳ型膠原能加強(qiáng)表真皮的粘附,但如要形成結(jié)構(gòu)完整的基底膜,需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,增加外源性Ⅳ型膠原的接種量等;各代次角質(zhì)形成細(xì)胞均有絲聚合蛋白,說(shuō)明復(fù)方殼多