組織工程真皮修復糖尿病裸鼠皮膚缺損的實驗研究.pdf

1、隨著生活水平提高，生活模式改變及社會老齡化，糖尿病發(fā)病率逐年增高。糖尿病皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿〕Ｒ姴l(fā)癥之一，多與糖尿病病程、病情關(guān)系密切。目前對于糖尿病皮膚潰瘍，臨床上常規(guī)治療為控制感染、血管重建、減壓治療和清創(chuàng)術(shù)。但常規(guī)的治療并不能取得令人滿意的治療效果。近年來隨著組織工程學的建立和發(fā)展，并且在臨床各個領域成功應用，使糖尿病皮膚潰瘍的治療方法有了更多新的選擇。 治療糖尿病皮膚潰瘍的組織工程皮膚的類型主要有以下幾種：單純材料結(jié)合/不

2、結(jié)合生長因子，含細胞的三維支架材料復合物。各種生長因子在創(chuàng)面愈合過程中起到了一個關(guān)鍵的核心作用。由于生長因子本身是一種蛋白質(zhì)成分，糖尿病創(chuàng)面本身各種蛋白酶活性相應增強，生長因子會很快被創(chuàng)面中各種蛋白酶降解清除進而達不到其起作用所需要的濃度范圍；另一方面，各種生長因子高昂的價格也是不得不考慮的一個方面。而結(jié)合細胞的三維支架材料復合物，由于構(gòu)建的復合物中細胞能有效地分泌各種生長因子，成為人們進一步研究的方向。 糖尿病模型的制備方法目

3、前主要有，手術(shù)切除胰腺、化學藥物誘導、自發(fā)性糖尿病動物模型、轉(zhuǎn)基因動物等。目前糖尿病模型制備以化學藥物誘導最為常見，其化學藥物包括四氧嘧啶（Alloxan）和鏈脲佐菌素（STZ）。四氧嘧啶具有價格低廉、來源廣泛等優(yōu)勢。但其同時也造成肝、腎等組織出現(xiàn)中毒性損壞，而且部分模型出現(xiàn)自發(fā)緩解情況。而STZ是具有特異性破壞胰腺β細胞，引起胰島素分泌降低，血糖增高。并且其所建立模型穩(wěn)定，對肝腎等組織損壞性小。為避免組織工程中的人體細胞在動物實驗中發(fā)

4、生免疫排斥反應，裸鼠作為實驗動物成為一種很好的選擇。 因此，我們探討以小兒包皮真皮成纖維細胞為種子細胞，PGA為支架材料，應用組織工程方法構(gòu)建組織工程真皮。我們通過對裸鼠腹腔注射STZ，誘導糖尿病裸鼠模型形成。進而應用構(gòu)建好的組織工程真皮，進行研究修復糖尿病裸鼠皮膚缺損的可能性。 目的: 探討應用小兒包皮真皮成纖維細胞作為種子細胞、PGA作為支架材料構(gòu)建組織工程真皮，修復糖尿病裸鼠皮膚缺損的可行性。 方法

5、: 1．PGA支架材料與成纖維細胞構(gòu)建真皮替代物的實驗研究：小兒包皮真皮中分離的成纖維細胞，進行傳代擴增，觀察不同代次細胞體外增殖能力。將成纖維細胞接種PGA支架材料上。掃描電鏡觀察細胞材料粘附情況，H.E.染色對其進行組織形態(tài)觀察。用Hoechst方法檢測其生長曲線。檢測細胞材料復合物中分泌細胞外基質(zhì)情況：GAG和總膠原含量。檢測細胞材料復合物分泌生長因子情況：TGF－β1、VEGF和bFGF。 2．建立糖尿病裸鼠模型

6、的實驗研究：應用STZ對裸鼠進行腹腔注射，誘導產(chǎn)生糖尿病裸鼠模型。對誘導的糖尿病裸鼠模型進行血糖動態(tài)監(jiān)測。對糖尿病模型裸鼠和正常裸鼠的胰腺取材，進行H.E.染色觀察對比。驗證誘導糖尿病裸鼠皮膚具有創(chuàng)面難愈性：對糖尿病裸鼠及正常裸鼠皮膚糖含量進行檢測及對比觀察；對糖尿病裸鼠及正常裸鼠進行制造皮膚創(chuàng)面，以對創(chuàng)面愈合情況進行觀察和對比。 3．構(gòu)建真皮替代物修復糖尿病裸鼠皮膚缺損的實驗研究：以小兒真皮成纖維細胞為種子細胞，以PGA為支架

7、材料，構(gòu)建真皮替代物，對糖尿病裸鼠皮膚缺損進行修復。以小兒真皮成纖維細胞/PGA復合物為實驗組，以單純PGA材料為對照組，觀察創(chuàng)面愈合時間、創(chuàng)面愈合比例，術(shù)后4周取材 ，H.E染色觀察再生真皮層厚度、苦味酸染色觀察膠原纖維分布及含量。 結(jié)果: 1．PGA支架材料與成纖維細胞構(gòu)建真皮替代物的實驗研究：掃描電鏡觀察細胞在材料上生長良好，分泌細胞外基質(zhì)豐富，并隨時間進展，細胞逐漸融合，細胞外基質(zhì)分泌逐漸增多。H.E染色觀察成纖

8、維細胞均勻分布于真皮替代物中。細胞生長曲線測定表明細胞在材料上生長良好。細胞外基質(zhì)分泌表達檢測，GAG及膠原總含量隨著時間逐漸增加?？梢姍z測到細胞分泌生長因子TGF－β1及VEGF，但未能檢測到bFGF。 2．建立糖尿病裸鼠模型的實驗研究：分別以0、100mg、150mg、200mg/Kg的劑量腹腔注射STZ，實驗證明對于裸鼠進行STZ一次性腹腔注射的合適劑量為150mg/Kg。成模后裸鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病的臨床癥狀。

9、糖尿病裸鼠胰腺病理H.E染色切片和正常裸鼠相比，胰島細胞出現(xiàn)數(shù)目減少、細胞變性壞死等現(xiàn)象。糖尿病裸鼠皮膚糖含量檢測，同正常裸鼠相比，糖尿病裸鼠皮膚糖含量明顯增加，并與血糖值存在正相關(guān)性。皮膚創(chuàng)面缺損相關(guān)研究，可觀察到糖尿病裸鼠皮膚創(chuàng)面愈合率明顯小于正常裸鼠。 3．構(gòu)建真皮替代物修復糖尿病裸鼠皮膚缺損的實驗研究：觀察成纖維細胞/PGA復合物修復糖尿病裸鼠皮膚缺損，真皮替代物組創(chuàng)面愈合時間明顯短于單純PGA組和空白對照組，創(chuàng)面愈合比

10、例加快。HE染色觀察，真皮替代物組再生真皮層厚度明顯高于單純PGA組和空白對照組。苦味酸染色觀察可見真皮替代物組膠原纖維比單純PGA組和空白對照組較厚并且排列規(guī)則。 結(jié)論: 1．PGA具有良好的細胞相容性，兒童包皮真皮成纖維細胞能在其上較好的粘附和生長，能夠分泌細胞外基質(zhì)如GAG及膠原，并能分泌生長因子TGF－β1和VEGF。 2．通過腹腔注射一定劑量的STZ能夠誘導出糖尿病裸鼠模型，具備糖尿病臨床癥狀，胰島細胞