血管化組織工程骨修復(fù)獼猴脛骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：我們?cè)捎醚芑M織工程骨修復(fù)大動(dòng)物(山羊)20mm脛骨缺損，獲得了確切的修復(fù)效果。為了進(jìn)一步為臨床試驗(yàn)提供更詳細(xì)、可行的方法，我們選取獼猴為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在進(jìn)行解剖觀(guān)察后，提出了進(jìn)一步的血管化方法，通過(guò)對(duì)支架外型的特殊設(shè)計(jì)，允許血管和筋膜兩種血管化方法的并存和協(xié)同，這樣不僅加快了組織工程骨的血管化進(jìn)程，而且對(duì)成骨質(zhì)量的提高和時(shí)限的縮短等有了明顯的作用效果。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟跈z測(cè)獼猴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與β-磷酸三鈣的組織相容性，建立

2、可行的組織工程骨修復(fù)獼猴脛骨段性缺損的動(dòng)物模型，檢測(cè)組織工程骨體內(nèi)血管化程度和成骨情況，探究血管化程度與成骨質(zhì)量的關(guān)系。 方法： 第一部分：取傳三代獼猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)，將獼猴BMSC與β-TCP復(fù)合培養(yǎng)，單純細(xì)胞組作對(duì)照。所取樣本使用倒置相差顯微鏡，掃描電鏡觀(guān)察兩組細(xì)胞形態(tài)及增殖情況，MTT法半定量檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 第二部分：對(duì)一只自然死亡的獼猴進(jìn)行新鮮解剖，觀(guān)察其脛骨的形態(tài)及周?chē)苁慕馄事?/p>

3、徑；將11只獼猴雙側(cè)脛骨(共22處)制成中段20mm骨-骨膜缺損，隨機(jī)平均分成2組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各9側(cè))，實(shí)驗(yàn)組在缺損處填塞由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和具有特殊外型(側(cè)槽和中空管)的β-磷酸三鈣(β-TCP)支架體外構(gòu)建的復(fù)合物，在中空管內(nèi)移入隱動(dòng)、靜脈束的一段，工程骨外被帶蒂深筋膜；對(duì)照組只填塞組織工程骨。另外2只獼猴的無(wú)填充物脛骨缺損作空白對(duì)照。鋼板螺釘固定。在4、8、12周時(shí)間點(diǎn)分別行放射線(xiàn)檢測(cè)，墨汁灌注標(biāo)本，組織學(xué)檢測(cè)及標(biāo)

4、本大體觀(guān)察。 第三部分：將20只獼猴雙側(cè)脛骨(共40處)制成中段20mm骨-骨膜缺損，隨機(jī)平均分成4組(一個(gè)實(shí)驗(yàn)組和三個(gè)對(duì)照組，每組各9側(cè))，實(shí)驗(yàn)組在缺損處填塞由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和具有特殊外型(側(cè)槽和中空管)的β-磷酸三鈣(β-TCP)支架體外構(gòu)建的復(fù)合物，在中空管內(nèi)移入隱動(dòng)、靜脈束的一段，外被帶蒂深筋膜；其余3個(gè)對(duì)照組分別填塞組織工程骨并包裹筋膜、單純組織工程骨和單純支架組。另外2只獼猴的無(wú)填充物脛骨缺損作空白對(duì)照

5、。鋼板螺釘固定。在4、8、12周時(shí)間點(diǎn)分別行放射影像學(xué)評(píng)分和X射線(xiàn)阻射密度分析，以及血管面積和成骨圖像分析。得出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 第一部分：獼猴BMSCs體外增殖能力較強(qiáng)，在傳3代后的第6天達(dá)高峰。細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，在第3天就可見(jiàn)良好的定向分化能力。該支架材料與獼猴BMSCs具有良好的相容性。但材料在加入培養(yǎng)基后會(huì)出現(xiàn)崩解，對(duì)細(xì)胞的初期附著有一定影響。 第二部分：本實(shí)驗(yàn)以通過(guò)對(duì)組織工程骨材料外型的特殊設(shè)計(jì)

6、，采用血管植入和筋膜包裹的血管化方法修復(fù)獼猴雙側(cè)脛骨20mm缺損為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行了術(shù)后大體觀(guān)察、X線(xiàn)和組織學(xué)檢測(cè)，初步完成了模型的設(shè)計(jì)和檢測(cè)工作，認(rèn)為模型是可行的，為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)提供了參考，但需要更深入的研究。 第三部分： 一般觀(guān)察術(shù)后4周：4組標(biāo)本無(wú)明顯差異，均在兩接觸面、材料后面和鋼板側(cè)有部分結(jié)締組織或軟骨樣組織形成，中空管及側(cè)槽為軟組織填塞，材料與骨接觸面能折動(dòng)。A組材料中空管內(nèi)原植入血管腔內(nèi)充滿(mǎn)墨汁。材料本身

7、無(wú)明顯吸收。 術(shù)后8周：4組標(biāo)本觀(guān)察有差異。A組植入物除前面外，其余各面及與骨接觸面均有骨樣組織包裹，側(cè)槽及中空管也有骨樣組織填塞，植入血管觀(guān)察不清，不易折斷，材料1/3吸收；B組在植入物內(nèi)側(cè)面、前面及中空管內(nèi)無(wú)骨樣組織形成，其余各面及與骨接觸面僅有少部分骨樣組織形成，易折斷，材料無(wú)明顯吸收。C和D組植入物與骨接觸面僅有少部分骨樣組織形成，易折斷，材料無(wú)明顯吸收。4組標(biāo)本均有墨染，以A，B兩組最明顯。術(shù)后12周：4組標(biāo)本觀(guān)察有明

8、顯差異。A組植入物各面及中央部完全被骨樣組織所包裹或替代，堅(jiān)硬，折不斷，材料2/3被吸收；B組和C組植入物于內(nèi)側(cè)及前面仍有部分材料未被骨樣組織所包裹或替代，用力可以折斷，材料1/3被吸收。D組成骨罕見(jiàn)，材料無(wú)吸收，輕易彎折。 空白組(12 w)缺損處完全被肉芽組織填塞，無(wú)骨樣組織增生。 顯微鏡下觀(guān)察A組術(shù)后4周時(shí)在移植物邊緣、斷面及中央有少量新生骨組織——編織骨形成，臨近新骨處的材料孔隙內(nèi)也有新骨的形成和小“肺泡樣”墨染

9、結(jié)構(gòu)，植入血管腔內(nèi)墨染，材料較完整，孔隙未見(jiàn)擴(kuò)大。8周時(shí)新骨形成明顯增多，墨染血管樣結(jié)構(gòu)明顯增多，多靠近外緣及中央，于新骨與材料交接處可見(jiàn)破碎的材料，小顆粒狀，植入血管腔內(nèi)未見(jiàn)墨染。12周時(shí)移植物完全被骨樣組織所包裹，形成的骨樣組織把材料分成幾小塊，有骨小梁樣結(jié)構(gòu)形成。于新骨及剩下的材料中均能見(jiàn)到血管樣結(jié)構(gòu)，密度明顯增大。新骨中的血管樣結(jié)構(gòu)較粗大，走行直，少有分支；材料中的血管樣結(jié)構(gòu)多呈“肺泡狀”，分支多，串珠樣，孔隙之間有交通。于新骨

10、與材料交接處可見(jiàn)較多破碎的材料，小顆粒狀，此處的墨染血管樣結(jié)構(gòu)最多。 B組術(shù)后4周時(shí)在移植物邊緣、斷面有少量新生骨組織——編織骨形成，材料孔隙內(nèi)也有新骨的形成和小“肺泡樣”墨染結(jié)構(gòu)，植入血管腔內(nèi)墨染，材料較完整，孔隙未見(jiàn)擴(kuò)大。8周時(shí)新骨形成增多，墨染血管樣結(jié)構(gòu)明顯增多，多靠近外緣，于新骨與材料交接處可見(jiàn)破碎的材料，植入血管腔內(nèi)未見(jiàn)墨染。12周時(shí)形成的骨樣組織把材料大部分包被，有骨小梁樣結(jié)構(gòu)形成。于材料中央部少見(jiàn)血管樣結(jié)構(gòu)。

11、 C組術(shù)后4周時(shí)在移植物邊緣和中央未見(jiàn)新生骨組織，僅在斷面處有少量編織骨形成，移植物僅有一面(后面)外緣有小“肺泡樣”墨染結(jié)構(gòu)，移植物完整，孔隙未見(jiàn)增大。8周時(shí)在移植物邊緣、斷面有少量新生骨組織形成，僅在新骨與材料交接處可見(jiàn)較多墨染血管樣結(jié)構(gòu)，余處少見(jiàn)。12周時(shí)可見(jiàn)移植物有少部分吸收，新骨及血管樣結(jié)構(gòu)的形成量比同組8周的有所增加，但仍然很稀少。 D組4周時(shí)無(wú)成骨，移植物斷端處可見(jiàn)有少量墨染結(jié)構(gòu)。8周時(shí)僅在斷端可見(jiàn)少量成骨，墨染

12、結(jié)構(gòu)較4周時(shí)增加。12周時(shí)移植物斷端的成骨情況并未增加，墨染結(jié)構(gòu)也未增加。 血管面積及成骨面積分析各時(shí)間點(diǎn)上A組中央部和周?chē)康难軜咏Y(jié)構(gòu)面積及成骨面積與B、C和D組比較有顯著差異(P<0.01)。而且隨時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì)。B和C組中央部血管樣結(jié)構(gòu)面積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組周?chē)康难軜咏Y(jié)構(gòu)面積與C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 放射線(xiàn)觀(guān)察A組8周顯示移植物密度降低，兩斷面有連續(xù)性骨痂形成；12周

13、顯示移植物密度明顯降低，個(gè)別區(qū)域低于正常骨，連續(xù)性骨痂明顯。B和C組8周和12周移植物密度未見(jiàn)降低，斷面處有連續(xù)性骨痂。D組各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。 影像評(píng)分從正位X線(xiàn)片骨缺損部位阻射密度值中可以看出，4 w各組間無(wú)差異，B和C組各時(shí)間點(diǎn)間無(wú)差異；8、12 w A組與B和C間有差異，A組各時(shí)間點(diǎn)間有顯著差異(P<0.01)。A組各時(shí)間點(diǎn)阻射密度值呈減少趨勢(shì)，可能和材料被逐漸吸收有關(guān)。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)以通過(guò)對(duì)組織工程骨