帶血管蒂的組織工程骨構(gòu)建及修復骨缺損的動物實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　 組織工程技術(shù)為臨床骨缺損的治療提供了新的途徑,應(yīng)用組織工程技術(shù)在小型哺乳動物體內(nèi)構(gòu)建骨組織,修復中、小尺寸的骨缺損的方法已基本成熟。但是對于大型哺乳動物大范圍或受區(qū)血供不佳的骨缺損,由于移植物早期沒有獨立的血液供應(yīng),營養(yǎng)滲透不足,骨痂形成緩慢、成骨效果不穩(wěn)定。如何建立有效的血液供應(yīng),促進組織工程骨形成,縮短骨愈合時間是目前骨組織工程的研究重點,也是制約組織工程骨大規(guī)模臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。為此,我們參考臨床常用的帶血

2、管蒂的腓骨移植術(shù)式,在比格犬體內(nèi)進行帶血管蒂的組織工程骨構(gòu)建及修復骨缺損的研究；采用多種方法進行血管化檢測；并應(yīng)用CT進行長期成骨量化評價,對成骨過程中相關(guān)因素展開深入探討,為應(yīng)用顯微外科技術(shù)進行帶血管蒂的組織工程骨移植奠定大動物實驗基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.體外構(gòu)建細胞支架復合物:
　　 髂骨穿刺抽取比格犬骨髓,應(yīng)用Ficoll-Paquc PluS液通過密度梯度離心分離BMSCs,擴增、成骨誘導培養(yǎng)

3、BMSCs兩周,經(jīng)堿性磷酸酶、茜素紅、骨鈣素、骨橋蛋白染色確認表達成骨細胞相關(guān)蛋白后,將誘導的BMSCs接種于帶凹槽的珊瑚一羥基磷灰石支架繼續(xù)體外培養(yǎng)一周,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞在支架上生長情況。
　　 2.體內(nèi)構(gòu)建含隱動靜脈的組織工程骨,修復腓骨缺損:
　　 將細胞支架復合物植入比格犬下肢肌間隙,使隱動靜脈血管嵌入支架的凹槽中,4周后應(yīng)用B超、CT血管造影、血管鑄型和組織學染色觀察血管化情況,應(yīng)用組織工

4、程復合物修復腓骨標準骨缺損。組織工程復合物共分4組:’VSC組(帶血管蒂的細胞支架)、SC組(細胞支架)、VS組(帶血管蒂的空白支架)、S組(空白支架),移植后1、3、6、9月應(yīng)用CT和組織學方法分別評估在異位成骨環(huán)境(肌間隙)和骨缺損環(huán)境(腓骨缺損)組織工程骨形成及支架降解情況。
　　 3.系統(tǒng)分析細胞、血管、微環(huán)境因素對組織工程骨形成和支架降解的影響:
　　 由于CT值與骨組織密度近似線性關(guān)系,能夠較精確反映骨骼的骨

5、量信息,我們用相對CT值代表新生的組織工程骨量,即VSC組平均CT值與VS組平均CT值相減所得值為VSC組相對CT值；SC組平均CT值與S組平均CT值相減所得值為SC組相對CT值,不同時間點的相對CT值相減即為階段成骨量。應(yīng)用VS組和S組平均CT值評估支架降情況,不同時間點的平均CT值相減即為支架階段降解量。將四組支架在不同成骨環(huán)境下各時間點的CT值進行統(tǒng)計比較,分析細胞、血管、微環(huán)境因素對組織工程骨形成和支架降解的影響。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標

6、準誤表示,采用spss17.0軟件進行統(tǒng)計處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.BMSCs—CHA復合物體外構(gòu)建:BMSCs在體外成骨誘導培養(yǎng)后可迅速增殖、分化,成骨誘導的第二代BMSCs高表達成骨細胞相關(guān)標志物(堿性磷酸酶、茜素紅、骨鈣素、骨橋蛋白),接種CHA支架后貼壁生長良好,迅速增殖并產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)。
　　 2.BMSCs—CHA復合物血管化檢測:首次應(yīng)用B超、CT、血管

7、鑄型、組織學染色證實VSC組移植到下肢肌間隙內(nèi)四周后可形成含隱動靜脈的脈管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),可進行帶血管蒂移植。
　　 3.異位成骨環(huán)境成骨情況:組織學顯示VSC組3月后可見少量骨樣組織形成,6月后骨組織增多,9月后可見大量成熟骨組織,殘存少量支架。SC組3月后可見類骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu),未見明顯骨組織；6月可見類骨質(zhì)成熟形成骨組織,9個月可見骨組織進一步增多,支架殘余較多。VS組和S組支架孔隙中填充纖維結(jié)締組織,支架表面有大量炎癥細胞浸潤,支架

8、逐步降解,無骨組織形成。
　　 4.骨缺損環(huán)境成骨情況:組織學和CT影像證實VSC組和SC組修復腓骨標準缺損,VSC組優(yōu)于SC組；而VS組和S組形成纖維骨不連。
　　 5.種子細胞對組織工程骨形成的影響:通過比較分析VSC和VS組、SC和S組平均CT值變化情況,發(fā)現(xiàn)在異位成骨環(huán)境和骨缺損成骨環(huán)境中,四組支架均形成鮮明對比,VSC、SC組平均CT值隨時間延長逐步升高,形成組織工程骨,而VS、S組平均CT值隨時間延長逐步減低

9、,支架降解,無組織工程骨形成。各時間點平均CT值均具有統(tǒng)計學差異。
　　 6.血管化對組織工程骨形成的影響:通過分析VSC和SC組支架相對CT值變化情況,發(fā)現(xiàn)在異位成骨環(huán)境和骨缺損成骨環(huán)境中,兩組支架均有相似的變化趨勢,均隨時間逐步升高,不同時間點VSC組成骨量(相對CT值)高于SC組,具有統(tǒng)計學差異；但不同時間段內(nèi)階段成骨量(相對CT值之差)比較,僅0-3月有統(tǒng)計學差異。
　　 7.血管化對CHA支架降解的影響:通過分

10、析VS和S組支架CT值變化情況,發(fā)現(xiàn)在異位成骨環(huán)境和骨缺損成骨環(huán)境中,兩組支架均有相似的變化趨勢,均隨時間逐步降低,除1月外,各時間點VS組平均CT值低于S組,具有統(tǒng)計學差異；但不同時間段內(nèi)支架階段降解量(平均CT值之差)比較,僅0—3月有統(tǒng)計學差異。
　　 8.微環(huán)境對組織工程骨形成的影響:通過分析SC組在不同成骨環(huán)境相對CT值變化,發(fā)現(xiàn)在骨缺損成骨環(huán)境中各時間點成骨量(相對CT值)高于異位成骨環(huán)境,具有統(tǒng)計學差異；但不同時間

11、段內(nèi)階段成骨量(相對CT值之差)比較,0—3月、6—9月有統(tǒng)計學差異。
　　 9.微環(huán)境對CHA支架降解的影響:通過分析S組在不同成骨環(huán)境平均CT值變化,發(fā)現(xiàn)在骨缺損成骨環(huán)境中各時間點平均CT值低于異位成骨環(huán)境,具有統(tǒng)計學差異；不同時間段內(nèi)支架階段降解量(平均CT值之差)比較,各時間段均有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.在大動物比格犬異位成骨環(huán)境成功構(gòu)建帶血管蒂的組織工程骨。帶血管蒂的細胞支架復合物在體內(nèi)4

12、周后可以形成含隱動靜脈的脈管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),3月后支架表面可見少量組織工程骨的形成,9月后可見含哈弗氏系統(tǒng)樣的組織工程骨,帶血管蒂組織工程骨的形成進程明顯快于無血管蒂組,相關(guān)研究未見報道。
　　 2.應(yīng)用帶血管蒂的組織工程骨成功修復比格犬腓骨缺損,同時建立組織工程骨體內(nèi)血管化研究的大動物模型。本模型修復鄰近骨缺損無需顯微外科吻合,避免了吻合血管固有的失敗率；修復遠處骨缺損可應(yīng)用顯微外科移植技術(shù)。帶血管蒂的組織工程骨為構(gòu)建大體積組織工程