組織工程骨修復山羊大節(jié)段負重骨缺損的實驗研究.pdf

1、大節(jié)段負重骨缺損是臨床上一個常見而又棘手的難題,不僅骨缺損量大,而且常常因為骨膜、骨髓及周圍組織的毀損而缺少成骨的細胞源,易形成骨不連,遺留嚴重功能障礙.尤為重要的是,負重骨缺損不同于腔隙性骨缺損,不僅要求外形結(jié)構(gòu)的恢復,更要求功能的重建——即能夠滿足負重運動所要求的生物力學性能.目前臨床上仍以自體骨移植作為骨缺損修復的金標準,但取自體骨必然會造成供骨區(qū)的病殘,取骨量有限.為了避免自體骨移植的種種缺陷,人們對骨替代材料進行了不懈的探索,

2、開發(fā)出人工陶瓷、生物多聚物等材料,但由于缺乏生物活性,對大節(jié)段骨缺損的修復效果還不太理想.骨組織工程學使有成骨能力的種子細胞和具有骨傳導能力的支架材料相結(jié)合,明顯促進骨的再生和重塑,為大段負重骨缺損的修復提供了新的思路和方法.目前,骨組織工程研究集中在種子細胞、支架材料和二者的相互作用等方面,并在骨缺損的修復方面取得了顯著進展.然而這一技術用于修復大節(jié)段負重骨缺損尚缺乏足夠的實驗依據(jù),在種子細胞的獲取以及體外構(gòu)建組織工程骨技術方面仍有爭

3、議,更需要開發(fā)、篩選出既能滿足組織工程骨需要又經(jīng)濟實用的支架材料.為此,我們設計更加具有臨床參考意義的大動物試驗模型,研究自體骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)復合同種異體脫鈣骨基質(zhì)(deminerilized bone matrix, DBM)構(gòu)建組織工程骨修復大節(jié)段負重骨缺損的可行性,為組織工程骨用于臨床提供實驗依據(jù).首先,通過骨髓穿刺獲取MSCs,并在體外擴增、向成骨細胞誘導,獲取足量有成

4、骨潛能的種子細胞.結(jié)果顯示:1、接種后4到6天,體外培養(yǎng)的MSCs就可觀察到特異的成纖維樣集落形成單位,這是干細胞的特點之一.2、以3×10<'5>/cm<'2> 細胞密度接種的原代細胞9至12天長滿單層,以1×10<'4>cells/cm2接種的傳代細胞4至7天長滿單層;3、MSCs表達CD105而不表達CD45. 4、MSCs成骨誘導10-12天后形成鈣化結(jié)節(jié),表達堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣素,與成骨細胞的特征相符;5、流式細胞儀檢

5、查未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細胞中有異常倍數(shù)染色體.其次,制備山羊DBM,并研究其與MSCs的相互作用.結(jié)果顯示:1、DBM成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有高孔隙率和孔隙連通率;2、MSCs能在DBM的表面和更深的孔壁上粘附伸展和增植;3、對一般的接種方法,當接種細胞密度超過2×10<'6>/ml時,上架細胞數(shù)即不再增加,細胞在支架上的粘附率低于75﹪; 3、雙向接種法可使細胞上架率達到80~95﹪,支架上的粘附細胞數(shù)隨接種細胞的密度增高而增加.再次,細胞支架復合

6、體和DBM被分別植入羊背部肌袋內(nèi),研究其異位成骨能力.前者組織學檢查觀察到異位成骨,且以軟骨內(nèi)成骨為主、無明顯炎癥反應,而單純支架材料無異位成骨;二者X線片上均未見明顯的成骨影像.最后,使用山羊構(gòu)建負重骨大節(jié)段缺損的動物模型,研究組織工程骨修復骨缺損的成骨和重塑過程.結(jié)果顯示:1、術后4周實驗組的缺損區(qū)可觀察到軟骨內(nèi)成骨,12周骨缺損被新骨連接,24周新生骨組織重塑良好、已接近正常骨干;2、植入體內(nèi)2周后,支架材料內(nèi)即可觀察到血管形成,

7、12周形成豐富的血管網(wǎng);3、植入4周后DBM開始吸收,12周后幾乎完全吸收;5、隨修復時間延長,修復組織的力學性能逐漸增強,24周達到正常的85﹪.綜上所述,我們可以得出結(jié)論:1、MSCs的增殖能力強,并可定向誘導向成骨細胞分化,適合作為骨組織工程的種子細胞;2、DBM 具有良好的細胞和組織相容性,其生物降解性與體內(nèi)的成骨過程相匹配,是組織工程骨較理想的支架材料;3、雙向接種法能夠顯著提高種子細胞的上架率,有利于組織工程骨的體外構(gòu)建;4