表皮干細胞羊膜復合皮的構建與移植實驗.pdf

1、目的： 研究用Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化的人表皮干細胞為種子細胞、脫細胞羊膜為支架在體外構建復合皮膚進而移植修復兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面修復情況，探討其在創(chuàng)面修復中的作用，為其進一步的臨床應用奠定基礎。 方法： 取燒傷整形患者植皮手術剩余皮片標本，經胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，用Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化人表皮干細胞，以含表皮生長因子、角質細胞無血清培養(yǎng)液等組成的人表皮干細胞培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)

2、。觀察細胞形態(tài)及生長情況、計算其克隆形成率。均以角質細胞作對照。在體外將分離、純化的人表皮干細胞種植到脫細胞羊膜上，構建成人表皮干細胞脫細胞羊膜復合皮。 在新西蘭白兔背部制作全層皮膚缺損模型并隨機分組，分別用表皮干細胞羊膜復合皮、脫細胞羊膜移植覆蓋，以空白創(chuàng)面對照，觀察全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合情況。各組分別于術后1周、2周、3周、4周在部分創(chuàng)面取材行常規(guī)H E染色，免疫組織化學染色，觀察各組創(chuàng)面愈合過程中的組織結構改建情況。

3、 結果： 經Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化的人表皮干細胞，倒置相差顯微鏡觀察見細胞呈明顯克隆性生長并逐漸融合，其克隆形成率與角質細胞的克隆形成率分別為11.67％和4.67％，組間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。透射電鏡觀察見細胞胞核大，胞漿少，核漿比例大，胞漿內細胞器少。 用人表皮干細胞脫細胞羊膜復合皮、單純羊膜移植覆蓋修復兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面，以空白創(chuàng)面為對照。術后創(chuàng)面愈合時間分別為：13.78±1.06d、20

4、.89±1.28d、28.67±1.37d，組間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。術后創(chuàng)面愈合時的創(chuàng)面收縮率分別為：22.6±1.54％、29.3±1.41％、30.4±1.58％，組間比較人表皮干細胞羊膜復合皮組與單純羊膜組和空白對照組間的差異有顯著性意義(P＜0.05)，單純羊膜組與空白對照組組間比較差異無意義(P＞0.05)。常規(guī)HE染色觀察創(chuàng)面的改建情況顯示：表皮干細胞羊膜復合皮組創(chuàng)面術后7天，表皮細胞層較薄，表皮真皮連接界

5、面平坦，皮釘不明顯，真皮層中梭形成纖維細胞排列紊亂；術后14天，表皮細胞層增厚，細胞分層明顯，出現(xiàn)角質細胞層、顆粒細胞層、棘細胞層和基底細胞層，出現(xiàn)少量皮釘，真皮層梭形成纖維細胞排列與表皮層平行。單純羊膜組和空白對照組創(chuàng)面的改建則均較晚，同一時間點創(chuàng)面組織的改建沒有表皮干細胞羊膜復合皮組完善。免疫組織化學染色觀察顯示表皮干細胞羊膜復合皮組創(chuàng)面表皮細胞層CK19、HLA-DR術后7天有陽性表達。Ⅳ型膠原術后14天在基底細胞周圍呈線性表達、

6、較連續(xù)。單純羊膜組創(chuàng)面和空白對照組創(chuàng)面表皮細胞層CK19、HLA—DR術后7天表達陰性，Ⅳ型膠原術后14天有部分陽性表達，不連續(xù)。 結論： 休外構建的表皮干細胞羊膜復合皮移植修復兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面時，能加速創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合時間；創(chuàng)面愈合時的創(chuàng)面收縮率小。術后不同時間點創(chuàng)面組織常規(guī)HE染色和免疫組織化學染色示全層皮膚缺損創(chuàng)面上皮化快，真皮層梭形成纖維細胞排列有序化快，創(chuàng)面表皮層能檢測到人表皮干細胞存在。提示表皮干細