神經(jīng)干細(xì)胞共移植體體外構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過實(shí)驗(yàn)篩選合適的細(xì)胞外基質(zhì)，利用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells VECs)、細(xì)胞外基質(zhì)與神經(jīng)干神胞(neural stem cells NSCs)共同構(gòu)建神經(jīng)干細(xì)胞共移植體，以提高移植神經(jīng)干細(xì)胞存活和定向分化為神經(jīng)元，減少其凋亡。 方法：實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。一是利用無血清培養(yǎng)和細(xì)胞克隆培養(yǎng)技術(shù)，從新生Wistar大鼠(1-3d)海馬分離NSCs，進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代，采用免疫組織化

2、學(xué)法和熒光法做nestin染色鑒定；利用M199培養(yǎng)基，從新生1-7d Wistar大鼠大腦中分離腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定；選用不同的細(xì)胞外基質(zhì)包括多聚賴氨酸(poly-L-Lysine)，層粘連蛋白(LN)、Matrigel與兩種細(xì)胞進(jìn)行貼壁共培養(yǎng)，鏡下觀察與三組細(xì)胞外基質(zhì)共培養(yǎng)NSCs的存活、增殖、分化情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察不同時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、14d)NSCs定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)

3、細(xì)胞情況及NSCs增殖、凋亡情況。二是NSCs共移植體構(gòu)建及檢測：將傳代的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25％胰酶消化20min后，以3×10<'7>L<'-1>的密度接種在培養(yǎng)瓶中，12h貼壁后吸出腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，涂以一層細(xì)胞外基質(zhì)后，接種經(jīng)0.125％胰酶消化20 min后吹打成單細(xì)胞NSCs懸液，密度為6×10<'8>L<'-1>，加入NSCs完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)3-6h鏡下觀察NSCs完全貼壁后，吸出培養(yǎng)液，再涂以一薄層細(xì)胞外基質(zhì)，

4、再接種以上相同密度的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，加入NSCs完全培養(yǎng)液，共培養(yǎng)12-24h，形成分層結(jié)構(gòu)(VECs-細(xì)胞外基質(zhì)-NSCs-細(xì)胞外基質(zhì)-VECs)，經(jīng)適力吹打形成 NSCs共移植體，利用免疫熒光的方法，以Ⅷ因子標(biāo)記物標(biāo)記腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用 nestin標(biāo)記Nscs，檢測共移植體。將不同基質(zhì)構(gòu)建的共移植體接種于放有蓋玻片的六孔板中，加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，在3d、7d、14d鏡下觀察共移植體的生長情況。 結(jié)果： 1、N

5、SCs和VEcs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定：原代分離的單NSC 4d增生為神經(jīng)細(xì)胞球，傳代后，經(jīng)nestin免疫熒光染色，細(xì)胞球呈陽性；原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞6-8d長滿瓶壁，細(xì)胞呈多角形或扁平梭形，核卵圓形，Ⅷ：因子相關(guān)抗原陽性。 2、三種細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)NSCs分化影響：3d時(shí)MAP<'2>免疫組化陽細(xì)胞數(shù)，由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)明顯高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P<0.05)；7d時(shí)差距更加明顯(P<0.01)；1

6、4d時(shí)LN組高于Matrigel組差距不時(shí)顯，且兩者明顯高于多聚賴氨酸組(P<0.01)。3d時(shí)GFAP免疫組化陽細(xì)胞數(shù)，由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)高于由 Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P<0.05)，7d時(shí)三組差距不明顯，14d時(shí)多聚賴氨酸組和Matrigel組差距不明顯，但兩者明顯高于LN組(P<0.05)。3d、7d、14d時(shí)，GFAP+MAP<'2>免疫組化陽細(xì)胞數(shù)，由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)明顯高于由Matligel、

7、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P<0.01)。 3、LN的細(xì)胞粘附性較好，兩種細(xì)胞參與共建細(xì)胞數(shù)較高，共移植體平均細(xì)胞數(shù)8-15個(gè)，平均共移體直徑28μm，較合適體內(nèi)移植。 4、共培養(yǎng)中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和凋亡的檢測：隨著天數(shù)的增加，神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)也隨之增加，但3d時(shí)，LN組和Matrigel組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P<0.05)，7d時(shí)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)各組均增多，但LN組和Matrigel組。Brdu陽性細(xì)胞

8、數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P<0.01)，14d時(shí)各組細(xì)胞增殖明顯，LN組和Matrigel組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P<0.01)；在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、14d)可見LN組和Matrigel組Caspase/Brdu雙陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于多聚賴氨酸組。 5、共移植體活細(xì)胞鏡下所見及免疫熒光結(jié)果：通過分層貼壁共培養(yǎng)和適力吹打可以形成LN、VECs和NSCs特征性結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)以VECs和NSCs緊密相貼或VECs

9、半包NSCs為等征。鏡下可見共移植體細(xì)胞團(tuán)不規(guī)則，NSCs被腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞包繞或相互連貼，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核大，胞體不規(guī)則，明顯大于NSCs，NSCs折光性強(qiáng)。在200倍視野下，隨機(jī)選取100個(gè)共移植體進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，可見平均細(xì)胞數(shù)為8-15個(gè)，其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)平均2.8個(gè)。免疫熒光可見紅色Ⅷ：因子陽性VECs包被綠色nestin陽性NSCs，或相互粘貼。 結(jié)論： 1、層粘連蛋白具有良好的細(xì)胞粘附性，可使神經(jīng)干

10、細(xì)胞與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間很好的粘附，可形成大小適中的神經(jīng)干細(xì)胞共移植體。 2、層粘連蛋白較多聚賴氨酸和Matrigel有更好的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的能力，并誘導(dǎo)其定向分化為神經(jīng)元；從而使神經(jīng)干細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較少，有利于共移植體植入體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)替代作用。 3、層粘連蛋白能提高神經(jīng)干細(xì)胞存活，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并通過內(nèi)皮細(xì)胞間接地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。 4、層粘連蛋白較多聚賴氨酸和Matrigel