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1、目的:探索行之有效的組織工程韌帶(tissue-engineered ligament,TEL)構(gòu)建方法。 方法: (1)構(gòu)建攜帶人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因和增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)報告基因的重組腺病毒載體Ad.bFGF-eGFP,并進行鑒定、擴增。 (2)分離、
2、培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),利用Ad.bFGF-eGFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs,觀察BMSCs表達、分泌bFGF的情況,及bFGF對BMSCs增殖、分化及產(chǎn)生韌帶特異性細胞外基質(zhì)的影響。 (3)采用0.01%胰蛋白酶+1%DCA+核酸酶法及TBP法對兔髕韌帶行去細胞處理,并進行組織學及生物力學檢測,探索最佳的韌帶去細胞方法,構(gòu)建去細胞徹底、膠原結(jié)構(gòu)保持完整
3、、力學性能良好的去細胞韌帶支架。 (4)將轉(zhuǎn)染Ad.bFGF-eGFP的BMSCs種植于去細胞韌帶支架上,體外構(gòu)建組織工程韌帶,觀察種子細胞在支架上的生長、增殖情況。 結(jié)果: (1)成功構(gòu)建Ad.bFGF-eGFP,其中含有eGFP報告基因; (2)Ad.bFGF-eGFP轉(zhuǎn)染BMSCs后,bFGF蛋白大量表達、分泌,且顯著促進BMSCs增殖并向成纖維細胞表型分化及加強韌帶特異性細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生;
4、 (3)利用0.01%胰蛋白酶+1%DCA+核酸酶方法可完全去除韌帶細胞成分,所得去細胞韌帶支架力學性能良好、膠原結(jié)構(gòu)保持完整,優(yōu)于TBP法;(4)轉(zhuǎn)基因BMSCs在去細胞韌帶支架上生長良好,增殖顯著高于對照組。 結(jié)論: (1)經(jīng)轉(zhuǎn)染Ad.bFGF-eGFP改造的BMSCs增殖、向成纖維細胞表型分化及產(chǎn)生韌帶特異性細胞外基質(zhì)的能力顯著增強,符合構(gòu)建TEL種子細胞的要求; (2)0.01%胰蛋白酶+1%DCA+核酸
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